氏名

キノ クニキ

木野 邦器

職名

教授 (https://researchmap.jp/read0061440/)

所属

(先進理工学部)

連絡先

メールアドレス

メールアドレス
kkino@waseda.jp

URL等

研究者番号
60318764

本属以外の学内所属

兼担

理工学術院(大学院先進理工学研究科)

学内研究所等

ライフサポートイノベーション研究所

研究所員 2014年-2014年

理工学総合研究センター

兼任研究員 1989年-2006年

ナノテクノロジー研究所

研究員 2007年-2008年

実践的ナノ化学G

研究所員 2007年-2011年

ナノプロセス研究所

研究所員 2007年-2014年

ナノプロセス研究所

研究所員 2015年-

ライフサポートイノベーション研究所

研究所員 2015年-

理工学術院総合研究所(理工学研究所)

兼任研究員 2006年-2018年

理工学術院総合研究所(理工学研究所)

兼任研究員 2018年-

学歴・学位

学歴

-1979年 早稲田大学 理工学部 応用化学科
-1981年 早稲田大学 理工学研究科 応用生物化学

学位

工学博士 早稲田大学

経歴

1981年-1985年協和発酵工業(株)技術研究所 研究員
1985年-1988年協和発酵工業(株)東京研究所 研究員
1988年-1999年協和発酵工業(株)技術研究所 主任研究員
1999年-早稲田大学理工学部 教授
2004年-大阪大学工学部非常勤講師
2004年-鳥取大学工学部非常勤講師
2005年-独立行政法人科学技術振興機構研究開発戦略センター シニアフェロー

所属学協会

酵素工学研究会 委員

日本分子生物学会

日本生物工学会 東日本支部支部長

日本農芸化学会

日本化学会 代議員

研究分野

キーワード

生物・生体工学、応用微生物学・応用生物化学

科研費分類

生物学 / 生物科学 / 機能生物化学

研究シーズ

2-ナフトエ酸の酵素水酸化による白色発光

シーズ分野:ライフサイエンス

機能性ペプチドの合成法

シーズ分野:ライフサイエンス

研究テーマ履歴

微生物によるアミノ酸生合成に関する研究

研究テーマのキーワード:アミノ酸,生合成,酵素

個人研究

微生物による糖化合物生産に関する研究

研究テーマのキーワード:配糖体,酵素

個人研究

微生物による環境浄化に関する研究

研究テーマのキーワード:バイオリメディエーション

個人研究

微生物機能や酵素を利用した有用物質生産

個人研究

遺伝子工学を利用した微生物育種

個人研究

微生物代謝工学

個人研究

進化分子工学

個人研究

特殊環境微生物の探索と利用技術の開発

個人研究

論文

クエン酸発酵の分子機構に関する新たな視点

バイオサイエンスとインダストリー64(1)p.17 - 222006年01月-

多様化するバイオプロセス開発研究とゲノム情報の利用

日本微生物資源学会誌21(2)p.40 - 412005年12月-

Molecular Analysis of the Novel Reversible γ-Resorcylic Acid Decarboxylase Gene and Its Application to γ-Resorcylic Acid Production

International Chemical Congress of Pacific Basin Societies, Honolulu, Hawaiip.3392005年12月-

Role of Alternative Oxidase in Relation to Citric Acid Production by Aspergillus niger

International Chemical Congress of Pacific Basin Societies, Honolulu, Hawaiip.3342005年12月-

Characterization of a Novel Reversible γ-Resorcylic Acid Decarboxylase Catalyzing Regioselective Caboxylation of Resorcinol

International Chemical Congress of Pacific Basin Societies, Honolulu, Hawaiip.3332005年12月-

芳香族硫黄化合物の微生物分解と環境浄化への応用

硫酸と工業58(12)p.1 - 82005年12月-

Dibenzothiophene Desulfurizing Enzymes from Moderately Thermophilic Bacterium Bacillus subtilis WU-S2B:Purification, Characterization and Overexpression

J.Biosci.Bioeng.100(3)p.266 - 2732005年-

Production of D-Amino Acid Dipeptides utilizing D-Alanine-D-Alanine Ligases with Novel Substrate Specificity

J.Biosci.Bioeng.99p.623 - 6282005年-

Gene Cloning and Characterization of Mycobacterium phlei Flavin Reductase Involved in Dibezothiophene Desulfurization

J.Biosci.Bioeng.99p.577 - 5852005年-

Thermophilic Biodesulfurization of Various Heterocyclic Sulfur Compounds and Crude Straight-Run Light Gas Oil Fraction by a Newly Isolated Strain Mycobacterium phlei WU-0103

Curr.Microbiol.50(2)p.63 - 702005年-

クエン酸糸状菌Aspergillus nigerにおける活性酸素種に対する耐性へのalternative oxidaseの寄与

第5回糸状菌分子生物学コンファレンス(The 5th Conference on Fungal Genetics and Molecular Biology)、東京p.432005年11月-

L-アミノ酸アミノトランスフェラーゼのライブラリー構築と解析

日本生物工学会大会p.1452005年11月-

α−アミノ酸アミノトランスフェラーゼを用いた非天然型アミノ酸合成

日本生物工学会大会p.1452005年11月-

D-アミノ酸アミノトランスフェラーゼ高発現大腸菌を利用したD-アミノ酸の生産

日本生物l工学会大会p.1112005年11月-

Pseudomonas putida IFO12996由来低基質特異性アミノ酸ラセマーゼのランダム変異導入による基質特異性の改変

日本生物工学会大会p.1122005年11月-

Thermotoga maritima由来D-アラニン- D-アラニンリガーゼの基質特異性における金属イオン添加効果

日本生物工学会大会p.1122005年11月-

好熱性脱硫細菌Mycobacterium phlei WU-0103を宿主とした組換え体の作製による直留軽油の脱硫

日本生物工学会大会p.932005年11月-

クエン酸生産糸状菌Aspergillus niger におけるalternative oxidase 遺伝子(aox1)の破壊による活性酸素耐性の低下

日本生物工学会大会p.632005年11月-

非天然型アミノ酸合成法の開発とペプチド生産への展開

第8回RIBSバイオサイエンスシンポジウム、微生物科学の進展に期待するものー持続可能で豊かな社会の構築に向けてー:岡山県生物科学総合研究所主催2005年10月-

Pseudomonas putida由来低基質特異性アミノ酸ラセマーゼのクローニングとランダム変異導入による基質特異性の改変

第1回D-アミノ酸研究会、北里大学p.712005年09月-

D-アミノ酸アミノ基転移酵素の基質特異性評価と生産プロセスへの応用

第1回D-アミノ酸研究会、北里大学p.702005年09月-

Transcript levels of Alternative Oxidase Gene (aox1) under the Conditions of Citric Acid Production in Aspergillus niger.

12th European Congress on Biotechnology, Copenhagen, Denmarkp.1212005年08月-

Characterization and Gene Cloning of theγ-Resorcylic acid Decarboxylase for Application to Selective Production of γ-Resorcylic Acid.

12th European Congress on Biotechnology, Copenhagen, Denmarkp.1012005年08月-

D-Alanine-D-Alanine Ligases with Broad Substrate Specificities for the Effective Production of D-Amino Acid Dipeptides.

BioTrans 7th International Sympojium on Biocatalysis and Biotransformations, Delft, The Netherlandsp.1842005年07月-

多様化するバイオプロセス開発研究とゲノム情報の利用

日本微生物資源学会第12回大会:バイオテクノロジーシンポジウム「微生物資源の産業利用」、日本微生物資源学会・独立行政法人製品評価技術基盤機構共催2005年06月-

D-Alanine-D-Alanine Ligaseを利用したD-アミノ酸ジペプチドの合成

酵素工学ニュース:構想工学研究会p.10 - 162005年04月-

新規な可逆的脱炭酸酵素の精製および遺伝子解析とγ-レゾルシン酸の選択的生産への応用

日本化学会第85春季年会p.2F1 - 082005年03月-

微生物脱硫酵素の新機能、インドールの酸化反応によるインジゴの生成

日本農芸化学会大会p.2512005年03月-

クエン酸糸状菌Aspergillus niger W-2223Lにおけるシアン非感受性呼吸系酵素Aternative oxidase 遺伝子aox1の解析

日本農芸化学会大会p.2322005年03月-

2種類の好熱性脱硫細菌由来のフラビンレダクターゼに関する諸性質の比較

日本農芸化学会大会p.722005年03月-

Rhizobium radiobacter WU-0108由来可逆的γ-レゾルシン酸脱炭酸酵素の遺伝子のクローニングと生産への応用

日本農芸化学会大会p.692005年03月-

Thermotoga maritime ATCC43589由来D-アラニン-D-アラニンリガーゼの基質特異性と当該酵素を利用したD-アミノ酸ジペプチド生産

日本農芸化学会大会p.402005年03月-

D-アミノ酸アミノ基転移酵素を利用した脂肪族および芳香族アミノ酸の生産

日本農芸化学会大会p.382005年03月-

超好熱菌由来酵素遺伝子の大腸菌における発現

日本農芸化学会大会p.382005年03月-

α-アミノ酸に対しアミノ基転移活性を有する酵素のスクリーニング法の開発

日本農芸化学会大会p.382005年03月-

scherichia coli K-12株由来γ-glutamylcysteine synthetase の基質特異性解析

日本農芸化学会大会p.372005年03月-

Isolation of Dimethyl Sulfone-Degrading Microorganisms and Application to Odorless Degradation of Dimethyl Sulfoxide

J.Biosci.Bioeng.97(1)p.82 - 842004年-

Cloning of a gene encoding flavin reductase coupling with dibenzothiophene monooxygenase through coexpression screening using indigo production as selective indication

Biochem.Biophys.Res.Commun.313p.570 - 5752004年-

Reversible and nonoxidative γ-resorcylic acid decarboxylase: characterization and gene cloning of a novel enzyme catalyzing carboxylation of resorcinol, 1,3-dihydroxybenzene, from Rhizobium radiobacter

Biochem.Biophys.Res.Commun.324p.611 - 6202004年-

Reversible and nonoxidative γ-resorcylic acid decarboxylase: characterization and gene cloning of a novel enzyme catalyzing carboxylation of resorcinol, 1,3-dihydroxybenzene, from Rhizobium radiobacter

Biochem.Biophys.Res.Commun.324p.611 - 6202004年-

Identification and functional analysis of the genes encoding dibenzothiophene-desulfurizing enzymes from thermophilic bacteria

Appl.Microbiol.Biotechnol.65(6)p.703 - 7132004年-

Enhancement of Dibenzothiophene Desulfurizing Activity by Genetic Engineering of a Thermophilic Desulfurizing Bacterium Mycobacterium phei WU-F1.

2nd Ineternational Congress on Biocatalysis, Hamburg, Germanyp.792004年08月-

Enzymatic Synthesis ofγ-Resorcylic Acid by Regio-Selective Carboxylation of Resorcinol.

2nd Ineternational Congress on Biocatalysis, Hamburg, Germanyp.1432004年08月-

Characterization of Mycobacterium phlei WU-F1 as a Biocatalyst Applicable to Thermophilic Biodesulfurization of Light Gas Oil.

2nd Ineternational Congress on Biocatalysis, Hamburg, Germanyp.2622004年08月-

セロビオースホスホリラーゼを用いる-グルコシド合成

酵素工学研究会第52回講演会、東京p.462004年11月-

D-alanine-D-alanine ligaseの基質特異性の解析とD-アミノ酸ジペプチド合成への利用

酵素工学研究会第52回講演会、東京p.442004年11月-

クエン酸生産糸状菌Aspergillus niger由来Aternative oxidase 遺伝子(aox1)の転写解析

第4回糸状菌分子生物学コンファレンス、仙台p.512004年11月-

好熱性ジベンゾチオフェン脱硫細菌Bacillus subtilis WU-S2B由来フラビンレダクターゼの遺伝子クローニングおよび諸性質の検討

日本生物工学会大会p.1142004年09月-

Rhizobium radiobacter WU-0108由来の可逆的γ-レゾルシン酸脱炭酸酵素遺伝子のクローニング

日本生物工学会p.1972004年09月-

クエン酸生産糸状菌Aspergillus niger WU-2223L 由来alternative oxidase遺伝子(aoxI) の転写解析

日本生物工学会大会p.1372004年09月-

D-alanine-D-alanine ligaseを利用した各種D-アミノ酸ジペプチド合成

日本生物工学会大会p.1082004年09月-

Alteromonas (Cellvibrio) sp. E-1由来の成熟型-アガラーゼをコードする遺伝子(agaI-m)の大腸菌内における発現

日本生物工学会大会p.762004年09月-

排水および石油中に含まれる芳香族硫黄化合物の微生物分解

水処理技術45(10)p.5 - 112004年-

遺伝子組換えを利用した好熱性ジベンゾチオフェン脱硫細菌Mycobacterium phlei WU-F1の脱硫活性の向上

日本農芸化学会大会p.412004年03月-

位置選択的炭酸固定反応によりγ-レゾルシン酸を合成する新規な脱炭酸酵素の精製および諸性質の検討

日本農芸化学会大会p.132004年03月-

アミノ酸ラセマーゼ/リガーゼ共役系によるL-アミノ酸からのD-アミノ酸ジペプチド合成

日本農芸化学会大会p.1192004年03月-

Oxidative Degradation of Dimethyl Sulfoxide by Cryptococcus humicolus WU-2, a Newly Isolated Yeast

J.Biosci.Bioeng.95(1)p.109 - 1112003年-

Thermophilic biodesulfurization of hydrodesulfurized light gas oils by Mycrobacterium phlei WU-F1

FEMS Microbio.Lett.221(1)p.137 - 1422003年-

Thermophilic biodesulfurization of hydrodesulfurized light gas oils by Mycrobacterium phlei WU-F1

FEMS Microbio.Lett.221(1)p.137 - 1422003年-

Degradation of Dimethyl Sulfoxide by the Immobilized Cells of Hyphomicrobium denitrificans WU-K217

Biochem.Eng.J.15p.199 - 2042003年-

Selective α-Glucosylation of Eugenol byα-Glucosyl Transfer Enzyme of Xanthomonas campestris WU-9701

J.Biosci.Bioeng.96(2)p.199 - 2032003年-

二糖ホスポリラーゼを用いるグルコシド合成

酵素工学研究会第50回講演会要旨p.612003年10月-

微生物酵素によるヒドロキシ芳香族化合物への位置選択的炭酸固定反応

日本生物工学会大会p.2162003年09月-

微生物変換によるレゾルシノールからのγ-レゾルシン酸の選択的合成

日本生物工学会大会p.2162003年09月-

セロビオースホスホリラーゼを用いた配糖体合成

日本生物工学会大会p.562003年09月-

芳香族アミノ酸に対してラセミ化活性を有する微生物の探索

日本生物工学会大会p.562003年09月-

Alteromonas sp.E-1由来の菌体内β-アガラーゼ遺伝子の大腸菌における発現とネオアガロビオースの生産

日本生物工学会大会p.562003年09月-

Bacillus fusiformis WU-ATR-9由来D-amino acid aminotransferase によるD-トリプトファン合成

p.562003年09月-

好熱性ジベンゾチオフェン脱硫細菌Mycobacterium phlei WU-F1 の遺伝子組換えによる脱硫能力の強化

日本生物工学会大会p.2042003年09月-

マルトースホスホリラーゼを用いた配糖体合成

日本農芸化学会大会p.2492003年04月-

Xanthomonas campestris WU-9701由来のα-グルコース転移酵素を用いた1-プロパンチオールのα-アノマー選択的グルコシル化

日本農芸化学会大会p.2492003年04月-

低分子ゲル化剤としての機能を示すメントールマルトシドの酵素的合成

日本農芸化学会大会p.2492003年04月-

好熱性ジベンゾチオフェン脱硫細菌Mycobacterium phlei WU-F1からの異なるフラビンレダクターゼ遺伝子のクローニング

日本農芸化学会大会p.2332003年04月-

BamHI制限修飾系の発現量調節

日本化学会第83春季年会p.11432003年03月-

Xanthomonas campestris WU-9701が生産する新規グルコース転移酵素遺伝子(xgtA)の大腸菌における発現と有用α-グルコシドの効率的生産

日本化学会第83春季年会p.11432003年03月-

Xanthomonas campestris WU-9701のα-グルコース転移酵素を利用したヒドロキシエチルメタクリレートのα-アノマー選択的グルコシル化

日本化学会第83春季年会p.11432003年-

Xanthomonas campestris WU-9701のα-グルコース転移酵素を利用した1-プロパンチオールのα-アノマー選択的グルコシル化

日本化学会第83春季年会p.11422003年03月-

好熱性ナフトチオフェン脱硫細菌Mycobacterium phlei WU-0103の単離と軽油の微生物脱硫

日本化学会第83春季年会p.9622003年03月-

Rhodococcus sp. WU-K2Rによるナフトチオフェン脱硫経路の解析

日本化学会第83春季年会p.9612003年03月-

ジメチルスルホン分解微生物の分離と利用法の検討

日本化学会第83春季年会p.9612003年03月-

多様化するバイオプロセス開発

かずさBTフォーラム2003年-

香粧品原料として利用される含硫化合物の微生物生産

ファインケミカル32(21)p.26 - 342003年-

化粧品原料として期待される含硫化合物の微生物生産

フレグランスジャーナル31(3)p.16 - 222003年-

Functional Analysis of Moderately Thermophilic Dibenzothiophene Desulfurization Genes from Bacillus subtilis WU-S2.

9th International Symposium on the Genetics of Industrial Microorganisms, Gyeongju, Koreap.1522002年07月-

Molucular Cloning and Expession Analysis of Moderately Thermophilic Dibenzothiophene Desulfurization-Genes from Bacillus subtilis WU-S2B.

9th International Symposium on the Genetics of Industrial Microorganisms, Gyeongju, Koreap.1542002年07月-

Application of Recombinan E.coli Cells Expressing the Gene Encoding α-Glucosyl Transfer Enzyme of Xanthomonas campestris WU-9701 forα-Anomer-Selective Glucosylation of Menthol.

3rd European Symposium on Enzymes in Grain Processing, Leuven, Belgiump.922002年09月-

Application of Recombinan E.coli Cells Expressing the Gene Encoding α-Glucosyl Transfer Enzyme of Xanthomonas campestris WU-9701 forα-Anomer-Selective Glucosylation of Menthol.

3rd European Symposium on Enzymes in Grain Processing, Leuven, Belgiump.922002年09月-

α-Anomer-Selective Glucosylation of (+)-Catechin and Hydroquinone Using α-Glucosyl Transfer Enzyme of Xanthomonas campestris WU-9701.

3rd European Symposium on Enzymes in Grain Processing, Leuven, Belgiump.932002年09月-

Thermophilic Biodesulfurization of Dibenzothiophene and 2-Ethylnaphthothiophene by a Dibenzothiophene-desulfurizing Bacterium, Mycobacterium phei WU-F1

Appl.Microbiol. Biotecnol.58p.237 - 2412002年-

Cloning and Expression of Aspergillus niger icdA Gene Encoding Mitochondrial NADP+-Specific Isolate Dehydrogenase

J.Biosci,Bioeng.93(2)p.136 - 1442002年-

Enzymatic Synthesis of α-Arbutin by α-Anomer-Selective Glucosylation of Hydroquinone Using Lyophilized Cells of Xanthomonas campestris WU-9701

J.Biosci.Bioeng.93(3)p.328 - 3302002年-

Continuous Degradation of Dimethyl Sulfoxide to Sulfate Iron by Hyphomicrobium denitrificans WU-K217

J.Biosci.Bioeng.94(1)p.52 - 562002年-

Enzymatic Synthesis of l-Menthyl-α-Maltoside and l-Menthyl-α-Maltooligosides from l-Menthyl α-Glucoside by Cyclodextrin Glucanotransferase

J.Biosci.Bioeng.94(2)p.119 - 1232002年-

Biodesulfurization of Naphthothiophene and Benzothiophene trrough Selective Cleavage of Carbon-Sulfur Bonds by Rhodococcus sp. Strain WU-K2R

Appl.Environ.Microbiol.68(8)p.3867 - 38722002年-

Recycle Use of Sphingomonas sp. CDH-7 Cells for Continuous Degradation of Carbazole in the Presence of MgCl2

Curr.Microbiol.44(4)p.251 - 2562002年-

変異制限酵素

日本国特許庁特開2003-2598762002年03月-

糖転移反応を触媒する新規な酵素をコードする遺伝子および当該酵素の製造方法

日本国特許庁特開2003-2505592002年02月-

表面に凹凸化処理を施した粉ゴム,これを用いたゴム組成物及びタイヤ

日本国特許庁特開2003-231182002年11月-

微生物を用いた複素環硫黄化合物の脱硫方法

日本国特許庁特開2003-1350542001年10月-

ジメチルスルホキシドを含有する排水の処理方法及びジメチルスルホキシドを分解する微生物

日本国特許庁特開2003-714892001年09月-

微生物による多環芳香族化合物分解方法および多環芳香族化合物処理剤

日本国特許庁特開2003-704632001年09月-

好熱性ジベンゾチオフェン脱硫細菌Mycobacterium phlei WU-F1からのフラビンレダクターゼをコードする遺伝子のクローニングと発現

日本生物工学会大会p.1712002年10月-

好熱性ジベンゾチオフェン脱硫細菌Bacillus subtilis WU-S2Bからのフラビンレダクターゼをコードする遺伝子のクローニングと発現

日本生物工学会大会p.1712002年10月-

Hyphomicrobium denitrificans WU-K217の固定化菌体を用いたジメチルスルホキシド分解

日本生物工学会大会p.1512002年10月-

好熱性ナフトチオフェン脱硫細菌Mycobacterium phlei WU-0103による軽油の脱硫

日本生物工学会大会p.1512002年10月-

Xanthomonas campestris WU-9701由来の新規α-グルコース転移酵素遺伝子(xgtA)と周辺領域遺伝子の解析

日本生物工学会大会p.862002年10月-

Xanthomonas campestris WU-9701由来の新規α-グルコース転移酵素遺伝子(xgtA)の発現とα-グルコシド生産への応用

日本生物工学会大会p.862002年10月-

BamHⅠ制限修飾系の発現量調節

日本化学会第81春季年会p.9152002年03月-

制限酵素BamHⅠ耐熱化

日本化学会第81春季年会p.9152002年03月-

Xanthomonas campestris WU-9701が生産する新規グルコース転移酵素の遺伝子クローニング

日本化学会第81春季年会p.9002002年03月-

Xanthomonas campestris WU-9701由来のグルコース転移酵素を利用したオイゲノールのα- アノマー選択的グルコシル化

日本化学会第81春季年会p.9002002年03月-

新規清涼剤としてのℓ-メントールα-マルトシドの酵素的合成

日本化学会第81春季年会p.9002002年03月-

中等度好熱性細菌Mycobacterium phlei WU-F1を利用した軽油の微生物脱硫

日本化学会第81春季年会p.8882002年03月-

軽油の微生物脱硫を目的とした中等度高熱性細菌の単離

日本化学会第81春季年会p.8882002年03月-

Hyphomicrobium detrificans WU-K217によるジメチルスルホキシド分解

日本農芸化学会大会p.2332002年03月-

Xanthomonas campestris WU-9701由来の新規なグルコース転移酵素をコードする遺伝子のクローニング

日本農芸化学会大会p.342002年03月-

Xanthomonas campestris WU-9701由来のグルコース転移酵素を用いたオイゲノールのα-アノマー選択的グルコシル化

日本農芸化学会大会p.332002年03月-

Rhodococcus sp. WU-K2RとMycobacterium phlei WU-F1における異なる分解機構によるナフトチオフェンの脱硫

日本農芸化学会大会p.112002年03月-

ジベンゾチオフェン脱硫細菌Mycobacterium phlei WU-F1による軽油の高温脱硫

日本農芸化学会大会p.112002年03月-

Biodesulfurization of dibenzothiophene and its derivatives through the selective cleavage of carbon-sulfur bonds by a moderately thermophilic bacterium Bacillus subtilis WU-S2B

J. Biosci. Bioeng.91(3)p.262 - 2662001年-

α-Anomer-Selective Glucosylation of (+)-Catechin and Hydroquinone Using the   Xanthomonas campestris WU-9701 Enzyme.

4th Carbohydrate Bioengineering Meeting, Stockholm, Swedenp.632001年06月-

Thermophilic biodesulfurization of dibenzothiophene, napthothiophene and their derivatives by Mycobacterium phlei WU-F1

Biotrans 2001, Darmstadt, Germanyp.2512001年09月-

Cloning and Expression of the Genes Encoding Dibenzothiophene-Desulfurizing Enzymes of Bacillus subtilis WU-S2B

Biotrans 2001, Darmstadt, Germanyp.2502001年09月-

Termophilic Biodesulfurization of Dibenzothiophene and its Derivatives by Mycobacterium phei WU-F1

FEMS Microbiology Letters204p.129 - 1332001年-

ジメチルスルホキシドを含有する排水の処理方法及びジメチルスルホキシドを酸化する微生物

日本国特許庁特開2002-3602392001年06月-

耐熱性脱硫酵素とコードする遺伝子

日本国特許庁特開2002-2532472001年02月-

クエン酸生産糸状菌Aspergillus nigerにおけるシアン非感受性呼吸系遺伝子(aox1)の破壊

日本生物工学会大会2001年10月-

Alcaligenes piechaudii WU-JH2000によるピレンの分解

日本生物工学会大会p.1252001年10月-

中等度好熱性ジベンゾチオフェン脱硫細菌Bacillus subtilis WU-S2B由来の脱硫酵素遺伝子bdsABCの解析

日本生物工学会大会p.1172001年10月-

中等度好熱性ジベンゾチオフェン脱硫細菌Mycobacterium phlei WU-F1による軽油の脱硫

日本生物工学会大会p.1162001年10月-

Rhodococcus sp. WU-K2Rによるナフトチオフェンの微生物脱硫

日本生物工学会大会p.1162001年10月-

ジメチルスルホキシド含有廃水の処理技術

水処理技術42(12)p.563 - 5692001年-

発酵法によるL−アミノ酸の製造法

日本国特許庁特開2001-1575962000年-

α-Anomer-selective Glucosylation of(+)-catechin by the crude enzyme, showing glucosyl transfer activity of Xanthomonas campestris WU-9701

J. Biosci. Bioeng.90(6)p.625 - 6302000年-

α- Anomer - Selective Glucosylation of Menthol with High Yield through a Crystal Accumulation Reaction Using Lyophilized Cells of Xanthomonas campestris WU-9701

J. Biosci. Bioeng.89(2)p.138 - 1442000年-

Contribution of Cyanide - Insensitive Respiratory Pathway, Catalyzed by the Alternative Oxidase, to Citric Acid Production in Aspergillus niger

Biosci, Biotechnol, Biochem.64(10)p.2030 - 20352000年-

微生物を用いた複素環硫黄化合物の分解方法

日本国特許庁特開2002-2592000年06月-

固定化リパーゼを用いた短鎖脂肪酸エステルの製造法

日本国特許庁特願2000-35650 特開2001-2185922000年02月-

Xanthomonas campestris WU-9701由来の酵素を用いたカテキンα-グルコシドのアノマー選択的合成

日本化学会春季年会p 7932000年03月-

カルバゾール分解におけるマグネシウムイオン存在下でのSphingomonas sp.CDH-7休止菌体の再利用

日本農芸化学会大会p 3922000年03月-

Mycobacterium phei WU-F1によるジベンゾチオフェンの高温脱硫

日本農芸化学会大会p 3852000年03月-

Alteromonas sp. E-1由来のネオアガロテトラオースおよびネオアガロヘキサオース生産型菌体外β-アガラーゼ(AGAⅡ、AGAⅢ)の精製と諸性質

日本農芸化学会大会p 2362000年03月-

微生物によるジメチルスルホキシドの酸化分解

日本農芸化学会大会p 1912000年03月-

シアン非感受性呼吸系酵素alernative oxidaseをコードする染色体遺伝子aox1の解析

日本農芸化学会大会p 1082000年03月-

Aleromonas sp. E-1由来のネオアガロテトラオースおよびネオアガロヘキサオース生産型菌体外β-アガラーゼの精製と諸性質

日本生物工学会大会p 1561999年09月-

発酵法によるアミノ酸の製造法

日本国特許庁特開2001-869981999年-

固定化リパーゼを用いた香気エステルの合成

日本生物工学会大会p 1741999年09月-

Xanthomonas campestris WU-9701由来の酵素を用いたカテキンのアノマー選択的グルコシル化

日本生物工学会大会p 1801999年09月-

クエン酸生産菌Aspergillus niger由来のNADP+依存型イソクエン酸脱水素酵素をコードするcDNA転写量変化と大腸菌における発現

日本生物工学会大会p 1931999年09月-

Sphingomonas sp.の休止菌体におけるカルバゾール分解活性の回復法

日本生物工学会大会p 3131999年09月-

ビオチン活性物質の製造法

日本国特許庁公開平11-2853851999年10月-

α-グルコシダーゼによる配糖体の製造方法及び新規なα-グルコシダーゼ並びにその製造法

日本国特許庁特願平11-225840 特開2001-460961999年08月-

Process for Producing L-Amino Acids by Fermentation

US PatentUS059196701999年07月-

Process for Producing Aspartase and Process for Producing L-Aspartic Acid

US PatentUS059167821999年06月-

Escherichia coli 変異株による高収量スレオニン(Thr)発酵とその高生産機構の解析

日本農芸化学会大会p191998年04月-

糖ヌクレオチド類および複合糖質の製造法(Processes for Producing Sugar Nucleotides and Complex Carbohydrates)

US Patent、日本国特許庁(PCT出願)WO098112471998年03月-

Process for Producing L-Leucine

US PatentUS057443311998年04月-

芳香族アミノ酸の製造法

日本国特許庁第28106971998年07月-

発酵法によるL-スレオニンの製造法

日本国特許庁第28107391998年07月-

Hyperproduction of L-Threonine by an Escherichia coli Mutant with Impaired L-Threonine Uptake

Biosci. Biotech. Biochem.61(11)p.1877 - 18821997年-

Method for Producing L-Isoleucine with a Fermentation Process

US PatentUS056959721997年12月-

アミノ酸生産技術と最近の進歩

ハイテクインフォメーション/中国技術振興センター79,pp.14-191995年11月-

Fermentative Production of Tryptophan by a Stable Recombinant Strain of Corynebacterium glutamicum with a Modified Serine-biosynthetic Pathway

Biosci. Biotech. Biochem.58(4)p.674 - 6781994年-

Gene Cloning in Glutamic Acid Bacteria, The System and Its Applications

Proc. 4th Eur. Congr. Biotechnol. , Amsterdamp.767 - 7761987年-

Thiobacillus thiooxidansのニッケルイオンの取り込みと耐性の獲得

発酵工学会誌64(5)p.447 - 4501986年-

Threonine Production by the Lysine Producing Strain of Corynebacterium glutamicum with Amplified Threonine Biosynthetic Operon

Genetics of Industrial Microorganisms, B. Pliva, Zagreb, Yugoslaviap.217 - 2261986年-

Volatilization of Mercury from Mercuric Chloride by Thiobacillus thiooxidans

Agric. Biol. Chem.49(5)p.1513 - 15151985年-

Thiobacillus thiooxidansの電気化学ポテンシャルと菌体内アデニンヌクレオチド

発酵工学会誌62(2)p.57 - 611984年-

Biological Reduction of Ferric Iron- and Sulfur-oxidizing Bacteria

Agric. Biol. Chem.46(3)p.803 - 8051982年-

Biochemical Rust Removal by Thiobacillus ferrooxidans

European J. of Appl. Microbiol. Biotechnol.13p.128 - 1321981年-

化学無機独立栄養細菌の生化学的機能と利用に関する研究(第一報)重金属イオン耐性と有機物質化について

(財)旭硝子工業技術奨励会研究報告38p.279 - 2871981年-

Thiobacillus thiooxidansのエネルギー源選択性と元素硫黄代謝機構

発酵工学会誌59(5)p.415 - 4201981年-

独立栄養細菌の有機物資化能と生育粗害

発酵工学会誌58(3)p.123 - 1291980年-

イオウ酸化細菌の金属耐性と馴養効果

早稲田大学理工学研究所報告84p.33 - 371979年-

鉄酸化細菌による鉄金属表面の連続途錆と問題点

早稲田大学理工学研究所報告84p.27 - 321979年-

Molecular Analysis of the Novel Reversible γ-Resorcylic Acid Decarboxylase Gene and Its Application to γ-Resorcylic Acid Production

International Chemical Congress of Pacific Basin Societies, Honolulu, Hawaiip.3392005年12月-

Role of Alternative Oxidase in Relation to Citric Acid Production by Aspergillus niger

International Chemical Congress of Pacific Basin Societies, Honolulu, Hawaiip.3342005年12月-

Characterization of a Novel Reversible γ-Resorcylic Acid Decarboxylase Catalyzing Regioselective Caboxylation of Resorcinol

International Chemical Congress of Pacific Basin Societies, Honolulu, Hawaiip.3332005年12月-

Transcript levels of Alternative Oxidase Gene (aox1) under the Conditions of Citric Acid Production in Aspergillus niger.

12th European Congress on Biotechnology, Copenhagen, Denmarkp.S1212005年08月-

Characterization and Gene Cloning of theγ-Resorcylic acid Decarboxylase for Application to Selective Production of γ-Resorcylic Acid.

12th European Congress on Biotechnology, Copenhagen, Denmarkp.S1012005年08月-

D-Alanine-D-Alanine Ligases with Broad Substrate Specificities for the Effective Production of D-Amino Acid Dipeptides.

BioTrans 7th International Sympojium on Biocatalysis and Biotransformations, Delft, The Netherlandsp.1842005年07月-

Dibenzothiophene Desulfurizing Enzymes from Moderately Thermophilic Bacterium Bacillus subtilis WU-S2B:Purification, Characterization and Overexpression

100(3)p.266 - 2732005年-

Gene Cloning and Characterization of Mycobacterium phlei Flavin Reductase Involved in Dibezothiophene Desulfurization

J.Biosci.Bioeng.99(6)p.577 - 5852005年-

Production of D-Amino Acid Dipeptides utilizing D-Alanine-D-Alanine Ligases with Novel Substrate Specificity

J.Biosci.Bioeng.99(6)p.623 - 6282005年-

Thermophilic Biodesulfurization of Various Heterocyclic Sulfur Compounds and Crude Straight-Run Light Gas Oil Fraction by a Newly Isolated Strain Mycobacterium phlei WU-0103

Curr.Microbiol.50(2)p.63 - 702005年-

Enzymatic Synthesis ofγ-Resorcylic Acid by Regio-Selective Carboxylation of Resorcinol.

2nd Ineternational Congress on Biocatalysis, Hamburg, Germanyp.1432004年08月-

Characterization of Mycobacterium phlei WU-F1 as a Biocatalyst Applicable to Thermophilic Biodesulfurization of Light Gas Oil.

2nd Ineternational Congress on Biocatalysis, Hamburg, Germanyp.2622004年08月-

Enhancement of Dibenzothiophene Desulfurizing Activity by Genetic Engineering of a Thermophilic Desulfurizing Bacterium Mycobacterium phei WU-F1.

2nd Ineternational Congress on Biocatalysis, Hamburg, Germanyp.792004年08月-

Identification and functional analysis of the genes encoding dibenzothiophene-desulfurizing enzymes from thermophilic bacteria

Appl.Microbiol.Biotechnol.65(6)p.703 - 7132004年-

Reversible and nonoxidative γ-resorcylic acid decarboxylase: characterization and gene cloning of a novel enzyme catalyzing carboxylation of resorcinol, 1,3-dihydroxybenzene, from Rhizobium radiobacter

Biochem.Biophys.Res.Commun.324p.611 - 6202004年-

Cloning of a gene encoding flavin reductase coupling with dibenzothiophene monooxygenase through coexpression screening using indigo production as selective indication

Biochem.Biophys.Res.Commun.313p.570 - 5752004年-

Isolation of Dimethyl Sulfone-Degrading Microorganisms and Application to Odorless Degradation of Dimethyl Sulfoxide

J.Biosci.Bioeng.97(1)p.82 - 842004年-

Selective α-Glucosylation of Eugenol byα-Glucosyl Transfer Enzyme of Xanthomonas campestris WU-9701

J.Biosci.Bioeng.96(2)p.199 - 2032003年-

Degradation of Dimethyl Sulfoxide by the Immobilized Cells of Hyphomicrobium denitrificans WU-K217

Biochem.Eng.J.15p.199 - 2042003年-

Thermophilic biodesulfurization of hydrodesulfurized light gas oils by Mycrobacterium phlei WU-F1

FEMS Microbio.Lett.221(1)p.137 - 1422003年-

Oxidative Degradation of Dimethyl Sulfoxide by Cryptococcus humicolus WU-2, a Newly Isolated Yeast

J.Biosci.Bioeng.95(1)p.109 - 1112003年-

Recycle Use of Sphingomonas sp. CDH-7 Cells for Continuous Degradation of Carbazole in the Presence of MgCl2

Curr.Microbiol.44(4)p.251 - 2562002年-

Biodesulfurization of Naphthothiophene and Benzothiophene trrough Selective Cleavage of Carbon-Sulfur Bonds by Rhodococcus sp. Strain WU-K2R

Appl.Environ.Microbiol.68(8)p.3867 - 38722002年-

Enzymatic Synthesis of l-Menthyl-α-Maltoside and l-Menthyl-α-Maltooligosides from l-Menthyl α-Glucoside by Cyclodextrin Glucanotransferase

J.Biosci.Bioeng.94(2)p.119 - 1232002年-

Continuous Degradation of Dimethyl Sulfoxide to Sulfate Iron by Hyphomicrobium denitrificans WU-K217

J.Biosci.Bioeng.94(1)p.52 - 562002年-

Enzymatic Synthesis of α-Arbutin by α-Anomer-Selective Glucosylation of Hydroquinone Using Lyophilized Cells of Xanthomonas campestris WU-9701

J.Biosci.Bioeng.93(3)p.328 - 3302002年-

Cloning and Expression of Aspergillus niger icdA Gene Encoding Mitochondrial NADP+-Specific Isolate Dehydrogenase

J.Biosci,Bioeng.93(2)p.136 - 1442002年-

Thermophilic Biodesulfurization of Dibenzothiophene and 2-Ethylnaphthothiophene by a Dibenzothiophene-desulfurizing Bacterium, Mycobacterium phei WU-F1

Appl.Microbiol. Biotecnol.58p.237 - 2412002年-

α-Anomer-Selective Glucosylation of (+)-Catechin and Hydroquinone Using α-Glucosyl Transfer Enzyme of Xanthomonas campestris WU-9701.

3rd European Symposium on Enzymes in Grain Processing, Leuven, Belgiump.932002年09月-

Application of Recombinan E.coli Cells Expressing the Gene Encoding α-Glucosyl Transfer Enzyme of Xanthomonas campestris WU-9701 forα-Anomer-Selective Glucosylation of Menthol.

3rd European Symposium on Enzymes in Grain Processing, Leuven, Belgiump.922002年09月-

Molucular Cloning and Expession Analysis of Moderately Thermophilic Dibenzothiophene Desulfurization-Genes from Bacillus subtilis WU-S2B.

9th International Symposium on the Genetics of Industrial Microorganisms, Gyeongju, Koreap.1542002年07月-

Functional Analysis of Moderately Thermophilic Dibenzothiophene Desulfurization Genes from Bacillus subtilis WU-S2.

9th International Symposium on the Genetics of Industrial Microorganisms, Gyeongju, Koreap.1522002年07月-

Termophilic Biodesulfurization of Dibenzothiophene and its Derivatives by Mycobacterium phei WU-F1

FEMS Microbiology Letters204p.129 - 1332001年-

Cloning and Expression of the Genes Encoding Dibenzothiophene-Desulfurizing Enzymes of Bacillus subtilis WU-S2B

Biotrans 2001, Darmstadt, Germanyp.2502001年09月-

Thermophilic biodesulfurization of dibenzothiophene, napthothiophene and their derivatives by Mycobacterium phlei WU-F1

Biotrans 2001, Darmstadt, Germanyp.2512001年09月-

α-Anomer-Selective Glucosylation of (+)-Catechin and Hydroquinone Using the   Xanthomonas campestris WU-9701 Enzyme.

4th Carbohydrate Bioengineering Meeting, Stockholm, Swedenp.632001年06月-

Biodesulfurization of dibenzothiophene and its derivatives through the selective cleavage of carbon-sulfur bonds by a moderately thermophilic bacterium Bacillus subtilis WU-S2B

J. Biosci. Bioeng.91(3)p.262 - 2662001年-

α-Anomer-selective Glucosylation of(+)-catechin by the crude enzyme, showing glucosyl transfer activity of Xanthomonas campestris WU-9701

J. Biosci. Bioeng.90(6)p.625 - 6302000年-

Contribution of Cyanide - Insensitive Respiratory Pathway, Catalyzed by the Alternative Oxidase, to Citric Acid Production in Aspergillus niger

Biosci, Biotechnol, Biochem.64(10)p.2030 - 20352000年-

α- Anomer - Selective Glucosylation of Menthol with High Yield through a Crystal Accumulation Reaction Using Lyophilized Cells of Xanthomonas campestris WU-9701

J. Biosci. Bioeng.89(2)p.138 - 1442000年-

Hyperproduction of L-Threonine by an Escherichia coli Mutant with Impaired L-Threonine Uptake

Biosci. Biotech. Biochem.61(11)p.1877 - 18821997年-

Fermentative Production of Tryptophan by a Stable Recombinant Strain of Corynebacterium glutamicum with a Modified Serine-biosynthetic Pathway

Biosci. Biotech. Biochem.58(4)p.674 - 6781994年-

Gene Cloning in Glutamic Acid Bacteria, The System and Its Applications

Proc. 4th Eur. Congr. Biotechnol. , Amsterdamp.767 - 7761987年-

Threonine Production by the Lysine Producing Strain of Corynebacterium glutamicum with Amplified Threonine Biosynthetic Operon

Genetics of Industrial Microorganisms, B. Pliva, Zagreb, Yugoslaviap.217 - 2261986年-

Volatilization of Mercury from Mercuric Chloride by Thiobacillus thiooxidans

Agric. Biol. Chem.49(5)p.1513 - 15151985年-

Biological Reduction of Ferric Iron- and Sulfur-oxidizing Bacteria

Agric. Biol. Chem.46(3)p.803 - 8051982年-

Biochemical Rust Removal by Thiobacillus ferrooxidans

European J. of Appl. Microbiol. Biotechnol.13p.128 - 1321981年-

Enhanced synthesis of 5-hydroxy-L-tryptophan through tetrahydropterin regeneration

Hara, Ryotaro;Kino, Kuniki

AMB EXPRESS32013年-2013年

DOIWoS

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ISSN:2191-0855

Regioselective oxidation of indole- and quinolinecarboxylic acids by cytochrome P450 CYP199A2

Furuya, Toshiki;Kino, Kuniki

APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY85(6)p.1861 - 18682010年-2010年

DOIWoS

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ISSN:0175-7598

A Novel L-Amino Acid Ligase from Bacillus subtilis NBRC3134 Catalyzed Oligopeptide Synthesis

Kino, Kuniki;Arai, Toshinobu;Tateiwa, Daisuke

BIOSCIENCE BIOTECHNOLOGY AND BIOCHEMISTRY74(1)p.129 - 1342010年-2010年

DOIWoS

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ISSN:0916-8451

Genome mining approach for the discovery of novel cytochrome P450 biocatalysts

Furuya, Toshiki;Kino, Kuniki

APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY86(4)p.991 - 10022010年-2010年

DOIWoS

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ISSN:0175-7598

Novel metabolic pathway for salicylate biodegradation via phenol in yeast Trichosporon moniliiforme

Iwasaki, Yuichiro;Gunji, Hiroaki;Kino, Kuniki;Hattori, Takasumi;Ishii, Yoshitaka;Kirimura, Kohtaro

BIODEGRADATION21(4)p.557 - 5642010年-2010年

DOIWoS

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ISSN:0923-9820

Identification and characterization of a novel L-amino acid ligase from Photorhabdus luminescens subsp laumondii TT01

Kino, Kuniki;Noguchi, Atsushi;Arai, Toshinobu;Yagasaki, Makoto

JOURNAL OF BIOSCIENCE AND BIOENGINEERING110(1)p.39 - 412010年-2010年

DOIWoS

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ISSN:1389-1723

New L-Amino Acid Ligases Catalyzing Oligopeptide Synthesis from Various Microorganisms

Arai, Toshinobu;Kino, Kuniki

BIOSCIENCE BIOTECHNOLOGY AND BIOCHEMISTRY74(8)p.1572 - 15772010年-2010年

DOIWoS

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ISSN:0916-8451

Novel L-Amino Acid Ligases Catalyzing Oligopeptide Synthesis

Kino, Kuniki

YAKUGAKU ZASSHI-JOURNAL OF THE PHARMACEUTICAL SOCIETY OF JAPAN130(11)p.1463 - 14692010年-2010年

WoS

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ISSN:0031-6903

Identification of the Monooxygenase Gene Clusters Responsible for the Regioselective Oxidation of Phenol to Hydroquinone in Mycobacteria

Furuya, Toshiki;Hirose, Satomi;Osanai, Hisashi;Semba, Hisashi;Kino, Kuniki

APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY77(4)p.1214 - 12202011年-2011年

DOIWoS

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ISSN:0099-2240

Poly-alpha-Glutamic Acid Synthesis Using a Novel Catalytic Activity of RimK from Escherichia coli K-12

Kino, Kuniki;Arai, Toshinobu;Arimura, Yasuhiro

APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY77(6)p.2019 - 20252011年-2011年

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ISSN:0099-2240

Structure-Based Modification of D-Alanine-D-Alanine Ligase from Thermotoga maritima ATCC 43589 for Depsipeptide Synthesis

Nakagawa, Tomoki;Satake, Ryoko;Sato, Masaru;Kino, Kuniki

BIOSCIENCE BIOTECHNOLOGY AND BIOCHEMISTRY75(4)p.700 - 7042011年-2011年

DOIWoS

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ISSN:0916-8451

ATP Photosynthetic vesicles for light-driven bioprocesses

Hara, Kiyotaka Y.;Suzuki, Rie;Suzuki, Toshiharu;Yoshida, Masasuke;Kino, Kuniki

BIOTECHNOLOGY LETTERS33(6)p.1133 - 11382011年-2011年

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ISSN:0141-5492

Identification of the Regulator Gene Responsible for the Acetone-Responsive Expression of the Binuclear Iron Monooxygenase Gene Cluster in Mycobacteria

Furuya, Toshiki;Hirose, Satomi;Semba, Hisashi;Kino, Kuniki

JOURNAL OF BACTERIOLOGY193(20)p.5817 - 58232011年-2011年

DOIWoS

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ISSN:0021-9193

Purification, characterization, and gene identification of an alpha-glucosyl transfer enzyme, a novel type alpha-glucosidase from Xanthomonas campestris WU-9701

Sato, Toshiyuki;Hasegawa, Nobukazu;Saito, Jun;Umezawa, Satoru;Honda, Yuki;Kino, Kuniki;Kirimura, Kohtaro

JOURNAL OF MOLECULAR CATALYSIS B-ENZYMATIC80p.20 - 272012年-2012年

DOIWoS

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ISSN:1381-1177

Biotechnological Production of Caffeic Acid by Bacterial Cytochrome P450 CYP199A2

Furuya, Toshiki;Arai, Yuka;Kino, Kuniki

APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY78(17)p.6087 - 60942012年-2012年

DOIWoS

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ISSN:0099-2240

Novel CCK-dependent vasorelaxing dipeptide, Arg-Phe, decreases blood pressure and food intake in rodents

Kagebayashi, Tomomi;Kontani, Noriyasu;Yamada, Yuko;Mizushige, Takafumi;Arai, Toshinobu;Kino, Kuniki;Ohinata, Kousaku

MOLECULAR NUTRITION & FOOD RESEARCH56(9)p.1456 - 14632012年-2012年

DOIWoS

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ISSN:1613-4125

The structure of L-amino-acid ligase from Bacillus licheniformis

Suzuki, Michihiko;Takahashi, Yuichi;Noguchi, Atsushi;Arai, Toshinobu;Yagasaki, Makoto;Kino, Kuniki;Saito, Jun-ichi

ACTA CRYSTALLOGRAPHICA SECTION D-BIOLOGICAL CRYSTALLOGRAPHY68p.1535 - 15402012年-2012年

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ISSN:0907-4449

Microbial production of N-acetyl cis-4-hydroxy-l-proline by coexpression of the Rhizobium l-proline cis-4-hydroxylase and the yeast N-acetyltransferase Mpr1

Thi Mai Hoa Bach;Hara, Ryotaro;Kino, Kuniki;Ohtsu, Iwao;Yoshida, Nobuyuki;Takagi, Hiroshi

APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY97(1)p.247 - 2572013年-2013年

DOIWoS

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ISSN:0175-7598

The mycobacterial binuclear iron monooxygenases require a specific chaperonin-like protein for functional expression in a heterologous host

Furuya, Toshiki;Hayashi, Mika;Semba, Hisashi;Kino, Kuniki

FEBS JOURNAL280(3)p.817 - 8262013年-2013年

DOIWoS

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ISSN:1742-464X

Construction of photoenergetic mitochondria in cultured mammalian cells

Hara, Kiyotaka Y.;Wada, Takeyoshi;Kino, Kuniki;Asahi, Toru;Sawamura, Naoya

SCIENTIFIC REPORTS32013年-2013年

DOIWoS

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ISSN:2045-2322

Application of protein N-terminal amidase in enzymatic synthesis of dipeptides containing acidic amino acids specifically at the N-terminus

Arai, Toshinobu;Noguchi, Atsushi;Takano, Eriko;Kino, Kuniki

JOURNAL OF BIOSCIENCE AND BIOENGINEERING115(4)p.382 - 3872013年-2013年

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ISSN:1389-1723

NRPSs and amide ligases producing homopoly(amino acid)s and homooligo(amino acid)s

Hamano, Yoshimitsu;Arai, Toshinobu;Ashiuchi, Makoto;Kino, Kuniki

NATURAL PRODUCT REPORTS30(8)p.1087 - 10972013年-2013年

DOIWoS

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ISSN:0265-0568

L-Amino Acid Ligase from Pseudomonas syringae Producing Tabtoxin Can Be Used for Enzymatic Synthesis of Various Functional Peptides

Arai, Toshinobu;Arimura, Yasuhiro;Ishikura, Shun;Kino, Kuniki

APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY79(16)p.5023 - 50292013年-2013年

DOIWoS

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ISSN:0099-2240

Biocatalytic production of 5-hydroxy-2-adamantanone by P450cam coupled with NADH regeneration

Furuya, Toshiki;Kanno, Takaaki;Yamamoto, Hiroaki;Kimoto, Norihiro;Matsuyama, Akinobu;Kino, Kuniki

JOURNAL OF MOLECULAR CATALYSIS B-ENZYMATIC94p.111 - 1182013年-2013年

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ISSN:1381-1177

Reconstitution of Active Mycobacterial Binuclear Iron Monooxygenase Complex in Escherichia coli

Furuya, Toshiki;Hayashi, Mika;Kino, Kuniki

APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY79(19)p.6033 - 60392013年-2013年

DOIWoS

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ISSN:0099-2240

Identification and characterization of 2-oxoglutarate-dependent dioxygenases catalyzing selective cis-hydroxylation of proline and pipecolinic acid from actinomycetes

Hara, Ryotaro;Uchiumi, Naoko;Kino, Kuniki

JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY172p.55 - 582014年-2014年

DOIWoS

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ISSN:0168-1656

Catalytic activity of the two-component flavin-dependent monooxygenase from Pseudomonas aeruginosa toward cinnamic acid derivatives

Furuya, Toshiki;Kino, Kuniki

APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY98(3)p.1145 - 11542014年-2014年

DOIWoS

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ISSN:0175-7598

Regioselective synthesis of piceatannol from resveratrol: catalysis by two-component flavin-dependent monooxygenase HpaBC in whole cells

Furuya, Toshiki;Kino, Kuniki

TETRAHEDRON LETTERS55(17)p.2853 - 28552014年-2014年

DOIWoS

詳細

ISSN:0040-4039

Regio- and stereoselective oxygenation of proline derivatives by using microbial 2-oxoglutarate-dependent dioxygenases

Hara, Ryotaro;Uchiumi, Naoko;Okamoto, Naoko;Kino, Kuniki

BIOSCIENCE BIOTECHNOLOGY AND BIOCHEMISTRY78(8)p.1384 - 13882014年-2014年

DOIWoS

詳細

ISSN:0916-8451

A Coenzyme-Independent Decarboxylase/Oxygenase Cascade for the Efficient Synthesis of Vanillin

Furuya, Toshiki;Miura, Misa;Kino, Kuniki

CHEMBIOCHEM15(15)p.2248 - 22542014年-2014年

DOIWoS

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ISSN:1439-4227

Regioselective hydroxylation of aromatic carboxylic acids by cytochrome P450 CYP199A2 and its mutants

Furuya, Toshiki;Kino, Kuniki

NEW BIOTECHNOLOGY31p.S80 - S802014年-2014年

DOIWoS

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ISSN:1871-6784

Alteration of the substrate specificity of cytochrome P450 CYP199A2 by site-directed mutagenesis

Furuya, Toshiki;Shitashima, Yoh;Kino, Kuniki

JOURNAL OF BIOSCIENCE AND BIOENGINEERING119(1)p.47 - 512015年-2015年

DOIWoS

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ISSN:1389-1723

Refined Regio- and Stereoselective Hydroxylation of L-Pipecolic Acid by Protein Engineering of L-Proline cis-4-Hydroxylase Based on the X-ray Crystal Structure

Koketsu, Kento;Shomura, Yasuhito;Moriwaki, Kei;Hayashi, Mikiro;Mitsuhashi, Satoshi;Hara, Ryotaro;Kino, Kuniki;Higuchi, Yoshiki

ACS Synthetic Biology4(4)p.383 - 3922015年-2015年

DOIWoS

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ISSN:2161-5063

High-yield production of vanillin from ferulic acid by a coenzyme-independent decarboxylase/oxygenase two-stage process

Furuya, Toshiki;Miura, Misa;Kuroiwa, Mari;Kino, Kuniki

New Biotechnology32(3)p.335 - 3392015年-2015年

DOIWoS

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ISSN:1871-6784

Hydroxamate-based colorimetric assay to assess amide bond formation by adenylation domain of nonribosomal peptide synthetases

Hara, Ryotaro;Suzuki, Ryohei;Kino, Kuniki

ANALYTICAL BIOCHEMISTRY477p.89 - 912015年-2015年

DOIWoS

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ISSN:0003-2697

One-Pot Production of L-threo-3-Hydroxyaspartic Acid Using Asparaginase-Deficient Escherichia coli Expressing Asparagine Hydroxylase of Streptomyces coelicolor A3(2)

Hara, Ryotaro;Nakano, Masashi;Kino, Kuniki

APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY81(11)p.3648 - 36542015年-2015年

DOIWoS

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ISSN:0099-2240

Screening of Salt Taste Enhancing Dipeptides Based on a New Strategy Using L-Amino Acid Ligase

Kino, Haruka;Kakutani, Masanao;Hattori, Koichi;Tojo, Hiroaki;Komai, Tsuyoshi;Nammoku, Takashi;Kino, Kuniki

JOURNAL OF THE JAPANESE SOCIETY FOR FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY-NIPPON SHOKUHIN KAGAKU KOGAKU KAISHI62(6)p.274 - 2812015年-2015年

DOIWoS

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ISSN:1341-027X

Functional characterization of aconitase X as a cis-3-hydroxy-L-proline dehydratase

Watanabe, Seiya;Tajima, Kunihiko;Fujii, Satoshi;Fukumori, Fumiyasu;Hara, Ryotaro;Fukuda, Rio;Miyazaki, Mao;Kino, Kuniki;Watanabe, Yasuo

SCIENTIFIC REPORTS62016年-2016年

DOIWoS

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ISSN:2045-2322

微生物酵素の新規有用機能と利用(<特集>伝統的発酵微生物の新しい利用展開)

木野 邦器

生物工学会誌 : seibutsu-kogaku kaishi89(6)p.329 - 3312011年06月-2011年06月 

CiNii

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ISSN:09193758

創立90周年記念特集によせて(「環境」と生物工学,<特集>バイオ技術10年の軌跡,創立90周年記念特別企画)

木野 邦器

生物工学会誌 : seibutsu-kogaku kaishi90(4)2012年04月-2012年04月 

CiNii

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ISSN:09193758

人類存続のための技術として : これからの生物工学が目指す方向性,ビジョンとは(90周年記念座談会)

木野 邦器;大嶋 泰治;新名 惇彦;飯島 信司

生物工学会誌 : seibutsu-kogaku kaishi91(4)p.194 - 2042013年04月-2013年04月 

CiNii

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ISSN:09193758

Alteration of the substrate specificity of cytochrome P450 CYP199A2 by site-directed mutagenesis(ENZYMOLOGY, PROTEIN ENGINEERING, AND ENZYME TECHNOLOGY)

Furuya Toshiki;Shitashima Yoh;Kino Kuniki

Journal of bioscience and bioengineering119(1)p.47 - 512015年01月-2015年01月 

CiNii

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ISSN:13474421

概要:CYP199A2, a member of the cytochrome P450 family, is a monooxygenase that specializes in the oxidation of aromatic carboxylic acids. The crystal structure of CYP199A2 determined by Bell et al. (J. Mol. Biol., 383, 561-574, 2008) suggested that the S97 and S247 residues conferred the substrate specificity on this enzyme through interaction between the hydroxy side chains of these Ser residues and the carboxy group of the substrates. In this study, we attempted to design and construct CYP199A2 mutants that recognize hydroxy aromatic compounds as substrates by protein engineering. We speculated that substitution of the S97 and S247 residues with acidic amino acids Asp and Glu, which have carboxy side chains, would provide CYP199A2 mutants that recognize hydroxy aromatic compounds instead of aromatic carboxylic acids. The S97 and S247 residues were substituted with Asp and Glu using site-directed mutagenesis. In whole-cell assays with p-methylbenzylalcohol and phenol as hydroxy aromatic substrates, the S247D mutant regioselectively oxidized these compounds to 1,4-benzenedimethanol and hydroquinone, respectively, although the wild-type enzyme exhibited no oxidation activity for these compounds. Furthermore, the S97D, S247D, and S247E mutants acquired oxidation activity for p-cresol. Especially, the S247D mutant rapidly oxidized p-cresol; the whole cells expressing the S247D mutant completely converted 1 mM p-cresol to p-hydroxybenzylalcohol in only 30 min. These results also clearly demonstrate that S97 and S247 are important residues that control the substrate specificity of CYP199A2.

1P-058 微生物由来2-オキソグルタル酸依存型ジオキシゲナーゼを利用した多様なヒドロキシアミノ酸合成(酵素学,酵素工学,一般講演)

原 良太郎;中島 悠太;北辻 早希;山縣 海;椛沢 遼;木野 邦器

日本生物工学会大会講演要旨集672015年09月-2015年09月 

CiNii

1P-059 単一酵素によるAMPからのATP再生系の構築とアミノアシルプロリン合成への利用(酵素学,酵素工学,一般講演)

鈴木 伸;原 良太郎;木野 邦器

日本生物工学会大会講演要旨集672015年09月-2015年09月 

CiNii

3P-039 L-アミノ酸リガーゼへの変異導入による塩味増強ジペプチドPro-Glyの効率的合成法の開発(酵素学,酵素工学,一般講演)

木野 はるか;木野 邦器

日本生物工学会大会講演要旨集672015年09月-2015年09月 

CiNii

3P-040 L-アミノ酸リガーゼを利用した塩味増強効果を有するジペプチドの探索(酵素学,酵素工学,一般講演)

梅澤 覚;角谷 政尚;服部 宏一;東條 博昭;駒井 強;斉藤 司;木野 はるか;木野 邦器

日本生物工学会大会講演要旨集672015年09月-2015年09月 

CiNii

オリゴペプチド合成を触媒する新規アミノ酸リガーゼ

木野 邦器

薬学雑誌. 乙号130(11)p.1463 - 14692010年-2010年

CiNii

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ISSN:1347-5231

概要:  L-Amino acid ligase (EC 6.3.2.28) is a microbial enzyme catalyzing formation of an alpha-peptide bond from unprotected L-amino acids in an ATP-dependent manner. The YwfE protein from Bacillus subtilis 168 was the first reported L-amino acid ligase, and it synthesizes various dipeptides. Thereafter, several L-amino acid ligases were newly obtained by in silico analysis using the ATP-grasp motif. But these L-amino acid ligases synthesize only dipeptide and no longer peptide. A novel L-amino acid ligase capable of catalyzing oligopeptide synthesis is required to increase the variety of peptides. We have previously found a new member of L-amino acid ligase, RizA, from B. subtilis NBRC3134, a microorganism that produces the peptide-antibiotic rhizocticin. We newly found that a gene at approximately 9 kbp upstream of rizA encoded a novel L-amino acid ligase RizB. Recombinant RizB synthesized homo-oligomers of branched-chain amino acids consisting of 2 to 5 amino acids, and also synthesized various heteropeptides. RizB is the first reported L-amino acid ligase that catalyzes oligopeptide synthesis. In addition, we obtained L-amino acid ligases showing oligopeptide synthesis activities by in silico analysis using BLAST, which is a set of similarity search programs. These L-amino acid ligases showed low similarity in amino acid sequence, but commonly used branched-chain amino acids, such as RizB, as substrates. Furthermore, the spr0969 protein of Streptococcus pneumoniae synthesized longer peptides than those synthesized by RizB, and the BAD_1200 protein of Bifidobacteria adolescentis showed higher activity toward aromatic amino acids than toward branched-chain ones.

L-アミノ酸リガーゼを利用した塩味増強効果を有するジペプチドの探索

木野 はるか;角谷 政尚;服部 宏一;東條 博昭;駒井 強;南木 昂;木野 邦器

日本食品科学工学会誌62(6)p.274 - 2812015年-2015年

CiNii

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ISSN:1341-027X

概要:本研究ではジペプチドの有する機能性,特に呈味に着目し,塩味増強効果を有するジペプチドの探索を行い,Met-Glyを見出した.プロテアーゼにより切り出しやすいアミノ酸を含むジペプチドをターゲットとする新たな方法論に基づき,ジペプチドの合成には無保護のアミノ酸同士を直接連結可能なLalを用いた.Met-Glyの塩味増強効果の評価は官能と塩味センサーによる2つの異なる方法で行い,既知の塩味増強効果を有するジペプチドと比較して同等もしくはそれ以上の効果があることが示唆された.また,本スクリーニング方法は塩味増強に限らず様々な呈味に対する増強効果を有するジペプチドの探索に適用可能と考えている.今後の課題としては,より精度を上げたスクリーニングを行うための改良や,見出したMet-Glyの塩味増強のメカニズムの解明などがあげられる.

Novel metabolic pathway for salicylate biodegradation via phenol in yeast Trichosporon moniliiforme.

Iwasaki Yuichiro;Gunji Hiroaki;Kino Kuniki;Hattori Takasumi;Ishii Yoshitaka;Kirimura Kohtaro

Novel metabolic pathway for salicylate biodegradation via phenol in yeast Trichosporon moniliiforme.21(4)2010年-2010年

DOI

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ISSN:1572-9729

概要::A novel metabolic pathway was found in the yeast Trichosporon moniliiforme WU-0401 for salicylate degradation via phenol as the key intermediate. When 20 mM salicylate was used as the sole carbon source for the growth of strain WU-0401, phenol was detected as a distinct metabolite in the culture broth. Analysis of the products derived from salicylate or phenol through reactions with resting cells and a cell-free extract of strain WU-0401 indicated that salicylate is initially decarboxylated to phenol and then oxidized to catechol, followed by aromatic ring cleavage to form cis-cis muconate.

A novel L-amino acid ligase from Bacillus subtilis NBRC3134 catalyzed oligopeptide synthesis.

Kino Kuniki;Arai Toshinobu;Tateiwa Daisuke

A novel L-amino acid ligase from Bacillus subtilis NBRC3134 catalyzed oligopeptide synthesis.74(1)2010年-2010年

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ISSN:1347-6947

概要::L-Amino acid ligase catalyzes dipeptide synthesis from unprotected L-amino acids in an ATP-dependent manner. We have purified a new L-amino acid ligase, RizA, which synthesizes dipeptides whose N-terminus is Arg, from Bacillus subtilis NBRC3134, a microorganism that produces a rhizocticin peptide antibiotic. It was suggested that RizA is probably involved in rhizocticin biosynthesis. In this study, we performed sequence analysis of unknown regions around rizA, and newly identified a gene that encodes a protein that possesses an ATP-grasp motif upstream of rizA. This gene was designated rizB, and its recombinant protein was prepared. Recombinant RizB synthesized homo-oligomers of branched-chain L-amino acids and L-methionine consisting of two to five amino acids in an ATP-dependent manner. RizB also synthesized various heteropeptides. Further examination showed that RizB might elongate a peptide chain at the N-terminus. This is the first report on an L-amino acid ligase catalyzing oligopeptide synthesis.

Regioselective oxidation of indole- and quinolinecarboxylic acids by cytochrome P450 CYP199A2.

Furuya Toshiki;Kino Kuniki

Regioselective oxidation of indole- and quinolinecarboxylic acids by cytochrome P450 CYP199A2.85(6)2010年-2010年

DOI

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ISSN:1432-0614

概要::CYP199A2, a bacterial P450 monooxygenase from Rhodopseudomonas palustris, was previously reported to oxidize 2-naphthoic acid and 4-ethylbenzoic acid. In this study, we examined the substrate specificity and regioselectivity of CYP199A2 towards indole- and quinolinecarboxylic acids. The CYP199A2 gene was coexpressed with palustrisredoxin gene from R. palustris and putidaredoxin reductase gene from Pseudomonas putida to provide the redox partners of CYP199A2 in Escherichia coli. Following whole-cell assays, reaction products were identified by mass spectrometry and NMR spectroscopy.CYP199A2 did not exhibit any activity towards indole and indole-3-carboxylic acid, whereas this enzyme oxidized indole-2-carboxylic acid, indole-5-carboxylic acid, and indole-6-carboxylic acid. Indole-2-carboxylic acid was converted to 5- and 6-hydroxyindole-2-carboxylic acids at a ratio of 59:41. In contrast, the indole-6-carboxylic acid oxidation generated only one product, 2-indolinone-6-carboxylic acid,at a rate of 130 mol (mol P450)(-1) min(-1). Furthermore,CYP199A2 also oxidized quinoline-6-carboxylic acid,although this enzyme did not exhibit any activity towards quinoline and its derivatives with a carboxyl group at the C-2,C-3, or C-4 positions. The oxidation product of quinoline-6-carboxylic acid was identified to be 3-hydroxyquinoline-6-carboxylic acid, which was a novel compound. These results suggest that CYP199A2 may be a valuable biocatalyst for the regioselective oxidation of various aromatic carboxylic acids.

Genome mining approach for the discovery of novel cytochrome P450 biocatalysts.

Furuya Toshiki;Kino Kuniki

Genome mining approach for the discovery of novel cytochrome P450 biocatalysts.86(4)2010年-2010年

DOI

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ISSN:1432-0614

概要::Cytochrome P450 enzymes (P450s) are able to regioselectively and stereoselectively introduce oxygen into organic compounds under mild reaction conditions. These monooxygenases in particular easily catalyze the insertion of oxygen into less reactive carbon-hydrogen bonds. Hence, P450s are of considerable interest as oxidation biocatalysts. To date, although several P450s have been discovered through screening of microorganisms and have been further genetically engineered, the substrate range of these biocatalysts is still limited to fulfill the requirements for a large number of oxidation processes. On the other hand, the recent rapid expansion in the number of reported microbial genome sequences has revealed the presence of an unexpectedly vast number of P450 genes. This large pool of naturally evolved P450s has attracted much attention as a resource for new oxidation biocatalysts. In this review, we focus on aspects of the genome mining approach that are relevant for the discovery of novel P450 biocatalysts. This approach opens up possibilities for exploitation of the catalytic potential of P450s for the preparation of a large choice of oxidation biocatalysts with a variety of substrate specificities.

Identification and characterization of a novel L-amino acid ligase from Photorhabdus luminescens subsp. laumondii TT01.

Kino Kuniki;Noguchi Atsushi;Arai Toshinobu;Yagasaki Makoto

Identification and characterization of a novel L-amino acid ligase from Photorhabdus luminescens subsp. laumondii TT01.110(1)2010年-2010年

DOI

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ISSN:1347-4421

概要::L-amino acid ligase catalyzes dipeptide synthesis from unprotected L-amino acids in an ATP-dependent manner. We recently identified a new member of L-amino acid ligase, the plu1440 protein, from Photorhabdus luminescens subsp. laumondii TT01 by in silico analysis. This protein was found to synthesize dipeptides containing L-asparagine at the N-terminus, which is a novel substrate specificity.

New L-amino acid ligases catalyzing oligopeptide synthesis from various microorganisms.

Arai Toshinobu;Kino Kuniki

New L-amino acid ligases catalyzing oligopeptide synthesis from various microorganisms.74(8)2010年-2010年

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ISSN:1347-6947

概要::L-Amino acid ligase synthesizes various peptides from unprotected L-amino acids in an ATP-dependent manner. Known L-amino acid ligases catalyze only dipeptide synthesis, but recently we found that RizB of Bacillus subtilis NBRC 3134 catalyzes oligopeptide synthesis. In the present study, we searched for new members of the L-amino acid ligase group that catalyze oligopeptide synthesis. Several hypothetical proteins possessing the ATP-grasp motif were selected by in silico analysis. These recombinant proteins were assayed for L-amino acid ligase activity. We obtained five L-amino acid ligases showing oligopeptide synthesis activities. These proteins showed low similarity in amino acid sequence, but commonly used branched-chain amino acids, such as RizB, as substrates. Furthermore, the spr0969 protein of Streptococcus pneumoniae synthesized longer peptides than those synthesized by RizB, and the BAD_1200 protein of Bifidobacterium adolescentis showed higher activity toward aromatic amino acids than toward branched-chain ones. We also examined some of their characteristics.

[Novel L-amino acid ligases catalyzing oligopeptide synthesis].

Kino Kuniki

[Novel L-amino acid ligases catalyzing oligopeptide synthesis].130(11)2010年-2010年

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ISSN:0031-6903

概要::L-Amino acid ligase (EC 6.3.2.28) is a microbial enzyme catalyzing formation of an alpha-peptide bond from unprotected L-amino acids in an ATP-dependent manner. The YwfE protein from Bacillus subtilis 168 was the first reported L-amino acid ligase, and it synthesizes various dipeptides. Thereafter, several L-amino acid ligases were newly obtained by in silico analysis using the ATP-grasp motif. But these L-amino acid ligases synthesize only dipeptide and no longer peptide. A novel L-amino acid ligase capable of catalyzing oligopeptide synthesis is required to increase the variety of peptides. We have previously found a new member of L-amino acid ligase, RizA, from B. subtilis NBRC3134, a microorganism that produces the peptide-antibiotic rhizocticin. We newly found that a gene at approximately 9 kbp upstream of rizA encoded a novel L-amino acid ligase RizB. Recombinant RizB synthesized homo-oligomers of branched-chain amino acids consisting of 2 to 5 amino acids, and also synthesized various heteropeptides. RizB is the first reported L-amino acid ligase that catalyzes oligopeptide synthesis. In addition, we obtained L-amino acid ligases showing oligopeptide synthesis activities by in silico analysis using BLAST, which is a set of similarity search programs. These L-amino acid ligases showed low similarity in amino acid sequence, but commonly used branched-chain amino acids, such as RizB, as substrates. Furthermore, the spr0969 protein of Streptococcus pneumoniae synthesized longer peptides than those synthesized by RizB, and the BAD_1200 protein of Bifidobacteria adolescentis showed higher activity toward aromatic amino acids than toward branched-chain ones.

Identification of the monooxygenase gene clusters responsible for the regioselective oxidation of phenol to hydroquinone in mycobacteria.

Furuya Toshiki;Hirose Satomi;Osanai Hisashi;Semba Hisashi;Kino Kuniki

Identification of the monooxygenase gene clusters responsible for the regioselective oxidation of phenol to hydroquinone in mycobacteria.77(4)2011年-2011年

DOI

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ISSN:1098-5336

概要::Mycobacterium goodii strain 12523 is an actinomycete that is able to oxidize phenol regioselectively at the para position to produce hydroquinone. In this study, we investigated the genes responsible for this unique regioselective oxidation. On the basis of the fact that the oxidation activity of M. goodii strain 12523 toward phenol is induced in the presence of acetone, we first identified acetone-induced proteins in this microorganism by two-dimensional electrophoretic analysis. The N-terminal amino acid sequence of one of these acetone-induced proteins shares 100% identity with that of the protein encoded by the open reading frame Msmeg_1971 in Mycobacterium smegmatis strain mc(2)155, whose genome sequence has been determined. Since Msmeg_1971, Msmeg_1972, Msmeg_1973, and Msmeg_1974 constitute a putative binuclear iron monooxygenase gene cluster, we cloned this gene cluster of M. smegmatis strain mc(2)155 and its homologous gene cluster found in M. goodii strain 12523. Sequence analysis of these binuclear iron monooxygenase gene clusters revealed the presence of four genes designated mimABCD, which encode an oxygenase large subunit, a reductase, an oxygenase small subunit, and a coupling protein, respectively. When the mimA gene (Msmeg_1971) of M. smegmatis strain mc(2)155, which was also found to be able to oxidize phenol to hydroquinone, was deleted, this mutant lost the oxidation ability. This ability was restored by introduction of the mimA gene of M. smegmatis strain mc(2)155 or of M. goodii strain 12523 into this mutant. Interestingly, we found that these gene clusters also play essential roles in propane and acetone metabolism in these mycobacteria.

Structure-based modification of D-alanine-D-alanine ligase from Thermotoga maritima ATCC 43589 for depsipeptide synthesis.

Nakagawa Tomoki;Satake Ryoko;Sato Masaru;Kino Kuniki

Structure-based modification of D-alanine-D-alanine ligase from Thermotoga maritima ATCC 43589 for depsipeptide synthesis.75(4)2011年-2011年

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ISSN:1347-6947

概要::Depsipeptides are peptide-like polymers consisting of amino acids and hydroxy acids, and are expected to be new functional materials for drug-delivery systems and polymer science. In our previous study, D-alanyl-D-lactate, a type of depsipeptide, was enzymatically synthesized using D-alanine-D-alanine ligase from Thermotoga maritima ATCC 43589 (TmDdl) by Y207F substitution. Thereafter, in this study, further mutagenesis was introduced, based on structural comparison between TmDdl and a well-characterized D-alanine-D-alanine ligase from Escherichia coli. The S137A/Y207F mutant showed higher D-alanyl-D-lactate and lower D-alanyl-D-alanine synthesizing activity than the Y207F mutant. This suggests that substitution at the S137 residue contributes to product selectivity. Saturated mutagenesis on S137 revealed that the S137G/Y207F mutant showed the highest D-alanyl-D-lactate synthesizing activity. Moreover, the mutant showed broad substrate specificity toward D-amino acid and recognized D-lactate and D,L-isoserine as substrates. On the basis of these characteristics, various depsipeptides can be produced using S137G/Y207F-replaced TmDdl.

Identification of the regulator gene responsible for the acetone-responsive expression of the binuclear iron monooxygenase gene cluster in mycobacteria.

Furuya Toshiki;Hirose Satomi;Semba Hisashi;Kino Kuniki

Identification of the regulator gene responsible for the acetone-responsive expression of the binuclear iron monooxygenase gene cluster in mycobacteria.193(20)2011年-2011年

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ISSN:1098-5530

概要::The mimABCD gene cluster encodes the binuclear iron monooxygenase that oxidizes propane and phenol in Mycobacterium smegmatis strain MC2 155 and Mycobacterium goodii strain 12523. Interestingly, expression of the mimABCD gene cluster is induced by acetone. In this study, we investigated the regulator gene responsible for this acetone-responsive expression. In the genome sequence of M. smegmatis strain MC2 155, the mimABCD gene cluster is preceded by a gene designated mimR, which is divergently transcribed. Sequence analysis revealed that MimR exhibits amino acid similarity with the NtrC family of transcriptional activators, including AcxR and AcoR, which are involved in acetone and acetoin metabolism, respectively. Unexpectedly, many homologs of the mimR gene were also found in the sequenced genomes of actinomycetes. A plasmid carrying a transcriptional fusion of the intergenic region between the mimR and mimA genes with a promoterless green fluorescent protein (GFP) gene was constructed and introduced into M. smegmatis strain MC2 155. Using a GFP reporter system, we confirmed by deletion and complementation analyses that the mimR gene product is the positive regulator of the mimABCD gene cluster expression that is responsive to acetone. M. goodii strain 12523 also utilized the same regulatory system as M. smegmatis strain MC2 155. Although transcriptional activators of the NtrC family generally control transcription using the σ(54) factor, a gene encoding the σ(54) factor was absent from the genome sequence of M. smegmatis strain MC2 155. These results suggest the presence of a novel regulatory system in actinomycetes, including mycobacteria.

Biotechnological production of caffeic acid by bacterial cytochrome P450 CYP199A2.

Furuya Toshiki;Arai Yuka;Kino Kuniki

Biotechnological production of caffeic acid by bacterial cytochrome P450 CYP199A2.78(17)2012年-2012年

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ISSN:1098-5336

概要::Caffeic acid is a biologically active molecule that has various beneficial properties, including antioxidant, anticancer, and anti-inflammatory activities. In this study, we explored the catalytic potential of a bacterial cytochrome P450, CYP199A2, for the biotechnological production of caffeic acid. When the CYP199A2 enzyme was reacted with p-coumaric acid, it stoichiometrically produced caffeic acid. The crystal structure of CYP199A2 shows that Phe at position 185 is situated directly above, and only 6.35 Å from, the heme iron. This F185 residue was replaced with hydrophobic or hydroxylated amino acids using site-directed mutagenesis to create mutants with novel and improved catalytic properties. In whole-cell assays with the known substrate of CYP199A2, 2-naphthoic acid, only the wild-type enzyme hydroxylated 2-naphthoic acid at the C-7 and C-8 positions, whereas all of the active F185 mutants exhibited a preference for C-5 hydroxylation. Interestingly, several F185 mutants (F185V, F185L, F185I, F185G, and F185A mutants) also acquired the ability to hydroxylate cinnamic acid, which was not hydroxylated by the wild-type enzyme. These results demonstrate that F185 is an important residue that controls the regioselectivity and the substrate specificity of CYP199A2. Furthermore, Escherichia coli cells expressing the F185L mutant exhibited 5.5 times higher hydroxylation activity for p-coumaric acid than those expressing the wild-type enzyme. By using the F185L whole-cell catalyst, the production of caffeic acid reached 15 mM (2.8 g/liter), which is the highest level so far attained in biotechnological production of this compound.

The mycobacterial binuclear iron monooxygenases require a specific chaperonin-like protein for functional expression in a heterologous host.

Furuya Toshiki;Hayashi Mika;Semba Hisashi;Kino Kuniki

The mycobacterial binuclear iron monooxygenases require a specific chaperonin-like protein for functional expression in a heterologous host.280(3)2013年-2013年

DOI

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ISSN:1742-4658

概要::The mimABCD gene clusters in Mycobacterium smegmatis strain mc(2) 155 and Mycobacterium goodii strain 12523 encode binuclear iron monooxygenases that oxidize propane and phenol. In this study, we attempted to express each mimABCD gene cluster in a heterologous host. The actinomycetous strain Rhodococcus opacus B-4, which is phylogenetically close to Mycobacterium, was selected as the host. Each mimABCD gene cluster was cloned into the Rhodococcus-Escherichia coli shuttle vector, pTip-QC2, and then introduced into R. opacus cells. Although whole-cell assays were performed with phenol as a substrate, the transformed R. opacus cells did not oxidize this substrate. SDS/PAGE analysis revealed that the oxygenase large subunit MimA was expressed in the insoluble fraction of R. opacus cells. We found that a gene designated mimG, which lies downstream of mimABCD, exhibits similarity in the amino acid sequence of its product with the products of genes encoding the chaperonin GroEL. When the mimG gene was cloned and coexpressed with each mimABCD gene cluster in R. opacus strain B-4, this host successfully acquired oxidation activity towards phenol. SDS/PAGE and western blotting analyses demonstrated that MimA was clearly soluble when in the presence of MimG. These results indicated that MimG played essential roles in the productive folding of MimA, and that the resulting soluble MimA protein led to the active expression of MimABCD.

Application of protein N-terminal amidase in enzymatic synthesis of dipeptides containing acidic amino acids specifically at the N-terminus.

Arai Toshinobu;Noguchi Atsushi;Takano Eriko;Kino Kuniki

Application of protein N-terminal amidase in enzymatic synthesis of dipeptides containing acidic amino acids specifically at the N-terminus.115(4)2013年-2013年

DOI

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ISSN:1347-4421

概要::Dipeptides exhibit unique physiological functions and physical properties, e.g., l-aspartyl-l-phenylalanine-methyl ester (Asp-Phe-OMe, aspartame) as an artificial sweetener, and functional studies of peptides have been carried out in various fields. Therefore, to establish a manufacturing process for the useful dipeptides, we investigated its enzymatic synthesis by utilizing an l-amino acid ligase (Lal), which catalyzes dipeptide synthesis in an ATP-dependent manner. Many Lals were obtained, but the Lals recognizing acidic amino acids as N-terminal substrates have not been identified. To increase the variety of dipeptides that are enzymatically synthesized, we proposed a two-step synthesis: Asn-Xaa and Gln-Xaa (Asn, l-asparagine; Gln, l-glutamine; and Xaa, arbitrary amino acids) synthesized by Lals were continuously deamidated by a novel amidase, yielding Asp-Xaa and Glu-Xaa (Asp, l-aspartic acid; and Glu, l-glutamic acid). We searched for amidases that specifically deamidate the N-terminus of Asn or Gln in dipeptides since none have been previously reported. We focused on the protein N-terminal amidase from Saccharomyces cerevisiae (NTA1), and assayed its activity toward dipeptides. Our findings showed that NTA1 deamidated l-asparaginyl-l-valine (Asn-Val) and l-glutaminyl-glycine (Gln-Gly), but did not deamidate l-valyl-l-asparagine and l-alanyl-l-glutamine, suggesting that this deamidation activity is N-terminus specific. The specific activity toward Asn-Val and Gln-Gly were 190 ± 30 nmol min(-1) mg(-1)·protein and 136 ± 6 nmol min(-1) mg(-1)·protein. Additionally, we examined some characteristics of NTA1. Acidic dipeptide synthesis was examined by a combination of Lals and NTA1, resulting in the synthesis of 12 kinds of Asp-Xaa, including Asp-Phe, a precursor of aspartame, and 11 kinds of Glu-Xaa.

Catalytic activity of the two-component flavin-dependent monooxygenase from Pseudomonas aeruginosa toward cinnamic acid derivatives.

Furuya Toshiki;Kino Kuniki

Catalytic activity of the two-component flavin-dependent monooxygenase from Pseudomonas aeruginosa toward cinnamic acid derivatives.98(3)2014年-2014年

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ISSN:1432-0614

概要::4-Hydroxyphenylacetate 3-hydroxylases (HPAHs) of the two-component flavin-dependent monooxygenase family are attractive enzymes that possess the catalytic potential to synthesize valuable ortho-diphenol compounds from simple monophenol compounds. In this study, we investigated the catalytic activity of HPAH from Pseudomonas aeruginosa strain PAO1 toward cinnamic acid derivatives. We prepared Escherichia coli cells expressing the hpaB gene encoding the monooxygenase component and the hpaC gene encoding the oxidoreductase component. E. coli cells expressing HpaBC exhibited no or very low oxidation activity toward cinnamic acid, o-coumaric acid, and m-coumaric acid, whereas they rapidly oxidized p-coumaric acid to caffeic acid. Interestingly, after p-coumaric acid was almost completely consumed, the resulting caffeic acid was further oxidized to 3,4,5-trihydroxycinnamic acid. In addition, HpaBC exhibited oxidation activity toward 3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acid, ferulic acid, and coniferaldehyde to produce the corresponding ortho-diphenols. We also investigated a flask-scale production of caffeic acid from p-coumaric acid as the model reaction for HpaBC-catalyzed syntheses of hydroxycinnamic acids. Since the initial concentrations of the substrate p-coumaric acid higher than 40 mM markedly inhibited its HpaBC-catalyzed oxidation, the reaction was carried out by repeatedly adding 20 mM of this substrate to the reaction mixture. Furthermore, by using the HpaBC whole-cell catalyst in the presence of glycerol, our experimental setup achieved the high-yield production of caffeic acid, i.e., 56.6 mM (10.2 g/L) within 24 h. These catalytic activities of HpaBC will provide an easy and environment-friendly synthetic approach to hydroxycinnamic acids.

L-amino acid ligase from Pseudomonas syringae producing tabtoxin can be used for enzymatic synthesis of various functional peptides.

Arai Toshinobu;Arimura Yasuhiro;Ishikura Shun;Kino Kuniki

L-amino acid ligase from Pseudomonas syringae producing tabtoxin can be used for enzymatic synthesis of various functional peptides.79(16)2013年-2013年

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ISSN:1098-5336

概要::Functional peptides are expected to be beneficial compounds that improve our quality of life. To address the growing need for functional peptides, we have examined peptide synthesis by using microbial enzymes. l-Amino acid ligase (Lal) catalyzes the condensation of unprotected amino acids in an ATP-dependent manner and is applicable to fermentative production. Hence, Lal is a promising enzyme to achieve cost-effective synthesis. To obtain a Lal with novel substrate specificity, we focused on the putative Lal involved in the biosynthesis of the dipeptidic phytotoxin designated tabtoxin. The tabS gene was cloned from Pseudomonas syringae NBRC14081 and overexpressed in Escherichia coli cells. The recombinant TabS protein produced showed the broadest substrate specificity of any known Lal; it detected 136 of 231 combinations of amino acid substrates when dipeptide synthesis was examined. In addition, some new substrate specificities were identified and unusual amino acids, e.g., l-pipecolic acid, hydroxy-l-proline, and β-alanine, were found to be acceptable substrates. Furthermore, kinetic analysis and monitoring of the reactions over a short time revealed that TabS showed distinct substrate selectivity at the N and C termini, which made it possible to specifically synthesize a peptide without by-products such as homopeptides and heteropeptides with the reverse sequence. TabS specifically synthesized the following functional peptides, including their precursors: l-arginyl-l-phenylalanine (antihypertensive effect; yield, 62%), l-leucyl-l-isoleucine (antidepressive effect; yield, 77%), l-glutaminyl-l-tryptophan (precursor of l-glutamyl-l-tryptophan, which has antiangiogenic activity; yield, 54%), l-leucyl-l-serine (enhances saltiness; yield, 83%), and l-glutaminyl-l-threonine (precursor of l-glutamyl-l-threonine, which enhances saltiness; yield, 96%). Furthermore, our results also provide new insights into tabtoxin biosynthesis.

Reconstitution of active mycobacterial binuclear iron monooxygenase complex in Escherichia coli.

Furuya Toshiki;Hayashi Mika;Kino Kuniki

Reconstitution of active mycobacterial binuclear iron monooxygenase complex in Escherichia coli.79(19)2013年-2013年

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ISSN:1098-5336

概要::Bacterial binuclear iron monooxygenases play numerous physiological roles in oxidative metabolism. Monooxygenases of this type found in actinomycetes also catalyze various useful reactions and have attracted much attention as oxidation biocatalysts. However, difficulties in expressing these multicomponent monooxygenases in heterologous hosts, particularly in Escherichia coli, have hampered the development of engineered oxidation biocatalysts. Here, we describe a strategy to functionally express the mycobacterial binuclear iron monooxygenase MimABCD in Escherichia coli. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoretic analysis of the mimABCD gene expression in E. coli revealed that the oxygenase components MimA and MimC were insoluble. Furthermore, although the reductase MimB was expressed at a low level in the soluble fraction of E. coli cells, a band corresponding to the coupling protein MimD was not evident. This situation rendered the transformed E. coli cells inactive. We found that the following factors are important for functional expression of MimABCD in E. coli: coexpression of the specific chaperonin MimG, which caused MimA and MimC to be soluble in E. coli cells, and the optimization of the mimD nucleotide sequence, which led to efficient expression of this gene product. These two remedies enabled this multicomponent monooxygenase to be actively expressed in E. coli. The strategy described here should be generally applicable to the E. coli expression of other actinomycetous binuclear iron monooxygenases and related enzymes and will accelerate the development of engineered oxidation biocatalysts for industrial processes.

Enhanced synthesis of 5-hydroxy-l-tryptophan through tetrahydropterin regeneration.

Hara Ryotaro;Kino Kuniki

Enhanced synthesis of 5-hydroxy-l-tryptophan through tetrahydropterin regeneration.3(1)2013年-2013年

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ISSN:2191-0855

概要::5-Hydroxy-l-tryptophan (5-HTP) is a naturally occurring aromatic amino acid present in the seeds of the African plant Griffonia simplicifolia. Although 5-HTP has therapeutic effects in various symptoms, efficient method of producing 5-HTP has not been established. In this study, we developed a novel cofactor regeneration process to achieve enhanced synthesis of 5-HTP by using modified l-phenylalanine 4-hydroxylase of Chromobacterium violaceum. For the synthesis of 5-HTP using Escherichia coli whole cell bioconversion, l-tryptophan and 5-HTP degradation by E. coli endogenous catabolic enzymes should be considered. The tryptophanase gene was disrupted using the λ red recombination system, since tryptophanase is postulated as an initial enzyme for the degradation of l-tryptophan and 5-HTP in E. coli. For regeneration of the cofactor pterin, we screened and investigated several key enzymes, including dihydropteridine reductase from E. coli, glucose dehydrogenase from Bacillus subtilis, and pterin-4α-carbinolamine dehydratase from Pseudomonas syringae. Genes encoding these three enzymes were overexpressed in an E. coli tryptophanase-deficient host, resulting in the synthesis of 0.74 mM 5-HTP in the presence of 0.1 mM pterin and the synthesis of 0.07 mM 5-HTP in the absence of regeneration of pterin. These results clearly indicated the successful regeneration of pterin. Following optimization of the reaction conditions, 2.5 mM 5-HTP was synthesized with cofactor regeneration, while 0.8 mM 5-HTP was recovered without cofactor regeneration under the same reaction conditions, suggesting that the principle described here provides a new method for cofactor regeneration.

Identification and characterization of 2-oxoglutarate-dependent dioxygenases catalyzing selective cis-hydroxylation of proline and pipecolinic acid from actinomycetes.

Hara Ryotaro;Uchiumi Naoko;Kino Kuniki

Identification and characterization of 2-oxoglutarate-dependent dioxygenases catalyzing selective cis-hydroxylation of proline and pipecolinic acid from actinomycetes.1722014年-2014年

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ISSN:1873-4863

概要::Microbial hydroxylases were screened for the capacity to effect direct hydroxylation of proline and pipecolinic acid, based on genomic information. Of the eight candidates screened, 2-oxoglutarate-dependent hydroxylase from Streptosporangium roseum NBRC 3776(T) and aspartyl/asparaginyl β-hydroxylase from Catenulispora acidiphila NBRC 102108(T) showed both proline and pipecolinic acid hydroxylation activities. In the case of l-proline hydroxylation, both enzymes catalyzed the simultaneous formation of cis-3-hydroxy-l-proline and cis-4-hydroxy-l-proline, and cis-4-hydroxy-l-proline was preferentially produced. In the case of l-pipecolinic acid hydroxylation, both enzymes catalyzed the simultaneous formation of cis-3-hydroxy-l-pipecolinic acid and cis-5-hydroxy-l-pipecolinic acid. While the former enzyme preferentially produced cis-3-hydroxy-l-pipecolinic acid, the latter enzyme preferentially produced cis-5-hydroxy-l-pipecolinic acid.

Alteration of the substrate specificity of cytochrome P450 CYP199A2 by site-directed mutagenesis.

Furuya Toshiki;Shitashima Yoh;Kino Kuniki

Journal of bioscience and bioengineering119(1)2015年-2015年

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ISSN:1347-4421

概要::CYP199A2, a member of the cytochrome P450 family, is a monooxygenase that specializes in the oxidation of aromatic carboxylic acids. The crystal structure of CYP199A2 determined by Bell et al. (J. Mol. Biol., 383, 561-574, 2008) suggested that the S97 and S247 residues conferred the substrate specificity on this enzyme through interaction between the hydroxy side chains of these Ser residues and the carboxy group of the substrates. In this study, we attempted to design and construct CYP199A2 mutants that recognize hydroxy aromatic compounds as substrates by protein engineering. We speculated that substitution of the S97 and S247 residues with acidic amino acids Asp and Glu, which have carboxy side chains, would provide CYP199A2 mutants that recognize hydroxy aromatic compounds instead of aromatic carboxylic acids. The S97 and S247 residues were substituted with Asp and Glu using site-directed mutagenesis. In whole-cell assays with p-methylbenzylalcohol and phenol as hydroxy aromatic substrates, the S247D mutant regioselectively oxidized these compounds to 1,4-benzenedimethanol and hydroquinone, respectively, although the wild-type enzyme exhibited no oxidation activity for these compounds. Furthermore, the S97D, S247D, and S247E mutants acquired oxidation activity for p-cresol. Especially, the S247D mutant rapidly oxidized p-cresol; the whole cells expressing the S247D mutant completely converted 1 mM p-cresol to p-hydroxybenzylalcohol in only 30 min. These results also clearly demonstrate that S97 and S247 are important residues that control the substrate specificity of CYP199A2.

Regio- and stereoselective oxygenation of proline derivatives by using microbial 2-oxoglutarate-dependent dioxygenases.

Hara Ryotaro;Uchiumi Naoko;Okamoto Naoko;Kino Kuniki

Regio- and stereoselective oxygenation of proline derivatives by using microbial 2-oxoglutarate-dependent dioxygenases.78(8)2014年-2014年

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ISSN:1347-6947

概要::We evaluated the substrate specificities of four proline cis-selective hydroxylases toward the efficient synthesis of proline derivatives. In an initial evaluation, 15 proline-related compounds were investigated as substrates. In addition to l-proline and l-pipecolinic acid, we found that 3,4-dehydro-l-proline, l-azetidine-2-carboxylic acid, cis-3-hydroxy-l-proline, and l-thioproline were also oxygenated. Subsequently, the product structures were determined, revealing cis-3,4-epoxy-l-proline, cis-3-hydroxy-l-azetidine-2-carboxylic acid, and 2,3-cis-3,4-cis-3,4-dihydroxy-l-proline.

A coenzyme-independent decarboxylase/oxygenase cascade for the efficient synthesis of vanillin.

Furuya Toshiki;Miura Misa;Kino Kuniki

A coenzyme-independent decarboxylase/oxygenase cascade for the efficient synthesis of vanillin.15(15)2014年-2014年

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ISSN:1439-7633

概要::Vanillin is one of the most widely used flavor compounds in the world as well as a promising versatile building block. The biotechnological production of vanillin from plant-derived ferulic acid has attracted much attention as a new alternative to chemical synthesis. One limitation of the known metabolic pathway to vanillin is its requirement for expensive coenzymes. Here, we developed a novel route to vanillin from ferulic acid that does not require any coenzymes. This artificial pathway consists of a coenzyme-independent decarboxylase and a coenzyme-independent oxygenase. When Escherichia coli cells harboring the decarboxylase/oxygenase cascade were incubated with ferulic acid, the cells efficiently synthesized vanillin (8.0 mM, 1.2 g L(-1) ) via 4-vinylguaiacol in one pot, without the generation of any detectable aromatic by-products. The efficient method described here might be applicable to the synthesis of other high-value chemicals from plant-derived aromatics.

Refined regio- and stereoselective hydroxylation of L-pipecolic acid by protein engineering of L-proline cis-4-hydroxylase based on the X-ray crystal structure.

Koketsu Kento;Shomura Yasuhito;Moriwaki Kei;Hayashi Mikiro;Mitsuhashi Satoshi;Hara Ryotaro;Kino Kuniki;Higuchi Yoshiki

ACS synthetic biology4(4)2015年-2015年

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ISSN:2161-5063

概要::Enzymatic regio- and stereoselective hydroxylation are valuable for the production of hydroxylated chiral ingredients. Proline hydroxylases are representative members of the nonheme Fe(2+)/α-ketoglutarate-dependent dioxygenase family. These enzymes catalyze the conversion of L-proline into hydroxy-L-prolines (Hyps). L-Proline cis-4-hydroxylases (cis-P4Hs) from Sinorhizobium meliloti and Mesorhizobium loti catalyze the hydroxylation of L-proline, generating cis-4-hydroxy-L-proline, as well as the hydroxylation of L-pipecolic acid (L-Pip), generating two regioisomers, cis-5-Hypip and cis-3-Hypip. To selectively produce cis-5-Hypip without simultaneous production of two isomers, protein engineering of cis-P4Hs is required. We therefore carried out protein engineering of cis-P4H to facilitate the conversion of the majority of L-Pip into the cis-5-Hypip isomer. We first solved the X-ray crystal structure of cis-P4H in complex with each of L-Pro and L-Pip. Then, we conducted three rounds of directed evolution and successfully created a cis-P4H triple mutant, V97F/V95W/E114G, demonstrating the desired regioselectivity toward cis-5-Hypip.

Hydroxamate-based colorimetric assay to assess amide bond formation by adenylation domain of nonribosomal peptide synthetases.

Hara Ryotaro;Suzuki Ryohei;Kino Kuniki

Analytical biochemistry4772015年-2015年

PubMedDOI

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ISSN:1096-0309

概要::We demonstrated the usefulness of a hydroxamate-based colorimetric assay for predicting amide bond formation (through an aminoacyl-AMP intermediate) by the adenylation domain of nonribosomal peptide synthetases. By using a typical adenylation domain of tyrocidine synthetase (involved in tyrocidine biosynthesis), we confirmed the correlation between the absorbance at 490 nm of the l-Trp-hydroxamate-Fe(3+) complex and the formation of l-Trp-l-Pro, where l-Pro was used instead of hydroxylamine. Furthermore, this assay was adapted to the adenylation domains of surfactin synthetase (involved in surfactin biosynthesis) and bacitracin synthetase (involved in bacitracin biosynthesis). Consequently, the formation of various aminoacyl l-Pro formations was observed.

High-yield production of vanillin from ferulic acid by a coenzyme-independent decarboxylase/oxygenase two-stage process.

Furuya Toshiki;Miura Misa;Kuroiwa Mari;Kino Kuniki

New biotechnology32(3)2015年-2015年

PubMedDOI

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ISSN:1876-4347

概要::Vanillin is one of the world's most important flavor and fragrance compounds in foods and cosmetics. Recently, we demonstrated that vanillin could be produced from ferulic acid via 4-vinylguaiacol in a coenzyme-independent manner using the decarboxylase Fdc and the oxygenase Cso2. In this study, we investigated a new two-pot bioprocess for vanillin production using the whole-cell catalyst of Escherichia coli expressing Fdc in the first stage and that of E. coli expressing Cso2 in the second stage. We first optimized the second-step Cso2 reaction from 4-vinylguaiacol to vanillin, a rate-determining step for the production of vanillin. Addition of FeCl2 to the cultivation medium enhanced the activity of the resulting E. coli cells expressing Cso2, an iron protein belonging to the carotenoid cleavage oxygenase family. Furthermore, a butyl acetate-water biphasic system was effective in improving the production of vanillin. Under the optimized conditions, we attempted to produce vanillin from ferulic acid by a two-pot bioprocess on a flask scale. In the first stage, E. coli cells expressing Fdc rapidly decarboxylated ferulic acid and completely converted 75 mM of this substrate to 4-vinylguaiacol within 2 h at pH 9.0. After the first-stage reaction, cells were removed from the reaction mixture by centrifugation, and the pH of the resulting supernatant was adjusted to 10.5, the optimal pH for Cso2. This solution was subjected to the second-stage reaction. In the second stage, E. coli cells expressing Cso2 efficiently oxidized 4-vinylguaiacol to vanillin. The concentration of vanillin reached 52 mM (7.8 g L(-1)) in 24 h, which is the highest level attained to date for the biotechnological production of vanillin using recombinant cells.

One-Pot Production of L-threo-3-Hydroxyaspartic Acid Using Asparaginase-Deficient Escherichia coli Expressing Asparagine Hydroxylase of Streptomyces coelicolor A3(2).

Hara Ryotaro;Nakano Masashi;Kino Kuniki

Applied and environmental microbiology81(11)2015年-2015年

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ISSN:1098-5336

概要::We developed a novel process for efficient synthesis of L-threo-3-hydroxyaspartic acid (L-THA) using microbial hydroxylase and hydrolase. A well-characterized mutant of asparagine hydroxylase (AsnO-D241N) and its homologous enzyme (SCO2693-D246N) were adaptable to the direct hydroxylation of L-aspartic acid; however, the yields were strictly low. Therefore, the highly stable and efficient wild-type asparagine hydroxylases AsnO and SCO2693 were employed to synthesize L-THA. By using these recombinant enzymes, L-THA was obtained by L-asparagine hydroxylation by AsnO followed by amide hydrolysis by asparaginase via 3-hydroxyasparagine. Subsequently, the two-step reaction was adapted to one-pot bioconversion in a test tube. L-THA was obtained in a small amount with a molar yield of 0.076% by using intact Escherichia coli expressing the asnO gene, and thus, two asparaginase-deficient mutants of E. coli were investigated. A remarkably increased L-THA yield of 8.2% was obtained with the asparaginase I-deficient mutant. When the expression level of the asnO gene was enhanced by using the T7 promoter in E. coli instead of the lac promoter, the L-THA yield was significantly increased to 92%. By using a combination of the E. coli asparaginase I-deficient mutant and the T7 expression system, a whole-cell reaction in a jar fermentor was conducted, and consequently, L-THA was successfully obtained from L-asparagine with a maximum yield of 96% in less time than with test tube-scale production. These results indicate that asparagine hydroxylation followed by hydrolysis would be applicable to the efficient production of L-THA.

Alteration of the substrate specificity of l-amino acid ligase and selective synthesis of Met-Gly as a salt taste enhancer.

Kino Haruka;Kino Kuniki

Bioscience, biotechnology, and biochemistry79(11)2015年-2015年

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ISSN:1347-6947

概要::Dipeptides have unique physiological functions. This study focused on the salt-taste-enhancing dipeptide Met-Gly. BL00235, an l-amino acid ligase from Bacillus licheniformis NBRC12200, synthesizes Met-Gly as a major product as well as Met-Met as a by-product. To alter the substrate specificity of BL00235 and synthesize Met-Gly selectively, we chose to alter Pro85 residue based on the BL00235 crystal structure. We predicted that Met might be not recognized as a C-terminal substrate by occupying the space around C-terminal substrate. Pro85 was replaced with Phe, Tyr, and Trp, which have bulky aromatic side chains, by site-directed mutagenesis. These mutants lost the capacity to synthesize Met-Met, during the synthesis of Met-Gly. Furthermore, they did not synthesize Met-Met, even when methionine was used as a substrate. These results show that the amino acid residue at position 85 has a key role in C-terminal substrate specificity.

Biocatalytic synthesis of 3,4,5,3',5'-pentahydroxy-trans-stilbene from piceatannol by two-component flavin-dependent monooxygenase HpaBC.

Furuya Toshiki;Sai Masahiko;Kino Kuniki

Bioscience, biotechnology, and biochemistry80(1)2015年-2015年

PubMedDOI

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ISSN:1347-6947

概要::HpaBC monooxygenase was previously reported to hydroxylate resveratrol to piceatannol. In this article, we report a novel catalytic activity of HpaBC for the synthesis of a pentahydroxylated stilbene. When Escherichia coli cells expressing HpaBC were incubated with resveratrol, the resulting piceatannol was further converted to a new product. This product was identified by mass spectrometry and NMR spectroscopy as a 5-hydroxylated piceatannol, 3,4,5,3',5'-pentahydroxy-trans-stilbene (PHS), which is a reportedly valuable biologically active stilbene derivative. We attempted to produce PHS from piceatannol on a flask scale. After examining the effects of detergents and buffers on PHS production, E. coli cells expressing HpaBC efficiently hydroxylated piceatannol to PHS in a reaction mixture containing 1.5% (v/v) Tween 80 and 100 mM 3-morpholinopropanesulfonic acid-NaOH buffer at pH 7.5. Under the optimized conditions, the whole cells regioselectively hydroxylated piceatannol, and the production of PHS reached 6.9 mM (1.8 g L(-1)) in 48 h.

Catalytic function of the mycobacterial binuclear iron monooxygenase in acetone metabolism.

Furuya Toshiki;Nakao Tomomi;Kino Kuniki

FEMS microbiology letters362(19)2015年-2015年

PubMedDOI

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ISSN:1574-6968

概要::Mycobacteria such as Mycobacterium smegmatis strain mc(2)155 and Mycobacterium goodii strain 12523 are able to grow on acetone and use it as a source of carbon and energy. We previously demonstrated by gene deletion analysis that the mimABCD gene cluster, which encodes a binuclear iron monooxygenase, plays an essential role in acetone metabolism in these mycobacteria. In the present study, we determined the catalytic function of MimABCD in acetone metabolism. Whole-cell assays were performed using Escherichia coli cells expressing the MimABCD complex. When the recombinant E. coli cells were incubated with acetone, a product was detected by gas chromatography (GC) analysis. Based on the retention time and the gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) spectrum, the reaction product was identified as acetol (hydroxyacetone). The recombinant E. coli cells produced 1.02 mM of acetol from acetone within 24 h. Furthermore, we demonstrated that MimABCD also was able to convert methylethylketone (2-butanone) to 1-hydroxy-2-butanone. Although it has long been known that microorganisms such as mycobacteria metabolize acetone via acetol, this study provides the first biochemical evidence for the existence of a microbial enzyme that catalyses the conversion of acetone to acetol.

Structure of RizA, an L-amino-acid ligase from Bacillus subtilis.

Kagawa Wataru;Arai Toshinobu;Ishikura Shun;Kino Kuniki;Kurumizaka Hitoshi

Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications71(Pt 9)2015年-2015年

PubMedDOI

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ISSN:2053-230X

概要::RizA is an L-amino-acid ligase from Bacillus subtilis that participates in the biosynthesis of rhizocticin, an oligopeptide antibiotic. The substrate-free form of RizA has been crystallized and the structure was solved at 2.8 Å resolution. The amino-acid-binding site appears to be capable of accommodating multiple amino acids, consistent with previous biochemical studies.

High-yield production of vanillin from ferulic acid by a coenzyme-independent decarboxylase/oxygenase two-stage process

Furuya, Toshiki; Miura, Misa; Kuroiwa, Mari; Kino, Kuniki

New Biotechnology32(3)p.335 - 3392015年05月-2015年05月 

PubMedDOIScopus

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ISSN:18716784

概要:© 2015 Elsevier B.V. Vanillin is one of the world's most important flavor and fragrance compounds in foods and cosmetics. Recently, we demonstrated that vanillin could be produced from ferulic acid via 4-vinylguaiacol in a coenzyme-independent manner using the decarboxylase Fdc and the oxygenase Cso2. In this study, we investigated a new two-pot bioprocess for vanillin production using the whole-cell catalyst of Escherichia coli expressing Fdc in the first stage and that of E. coli expressing Cso2 in the second stage. We first optimized the second-step Cso2 reaction from 4-vinylguaiacol to vanillin, a rate-determining step for the production of vanillin. Addition of FeCl2 to the cultivation medium enhanced the activity of the resulting E. coli cells expressing Cso2, an iron protein belonging to the carotenoid cleavage oxygenase family. Furthermore, a butyl acetate-water biphasic system was effective in improving the production of vanillin. Under the optimized conditions, we attempted to produce vanillin from ferulic acid by a two-pot bioprocess on a flask scale. In the first stage, E. coli cells expressing Fdc rapidly decarboxylated ferulic acid and completely converted 75mM of this substrate to 4-vinylguaiacol within 2h at pH 9.0. After the first-stage reaction, cells were removed from the reaction mixture by centrifugation, and the pH of the resulting supernatant was adjusted to 10.5, the optimal pH for Cso2. This solution was subjected to the second-stage reaction. In the second stage, E. coli cells expressing Cso2 efficiently oxidized 4-vinylguaiacol to vanillin. The concentration of vanillin reached 52mM (7.8gL-1) in 24h, which is the highest level attained to date for the biotechnological production of vanillin using recombinant cells.

Hydroxamate-based colorimetric assay to assess amide bond formation by adenylation domain of nonribosomal peptide synthetases

Hara, Ryotaro; Suzuki, Ryohei; Kino, Kuniki; Kino, Kuniki

Analytical Biochemistry477p.89 - 912015年05月-2015年05月 

PubMedDOIScopus

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ISSN:00032697

概要:© 2015 Elsevier Inc. All rights reserved. We demonstrated the usefulness of a hydroxamate-based colorimetric assay for predicting amide bond formation (through an aminoacyl-AMP intermediate) by the adenylation domain of nonribosomal peptide synthetases. By using a typical adenylation domain of tyrocidine synthetase (involved in tyrocidine biosynthesis), we confirmed the correlation between the absorbance at 490 nm of the l-Trp-hydroxamate-Fe3+ complex and the formation of l-Trp-l-Pro, where l-Pro was used instead of hydroxylamine. Furthermore, this assay was adapted to the adenylation domains of surfactin synthetase (involved in surfactin biosynthesis) and bacitracin synthetase (involved in bacitracin biosynthesis). Consequently, the formation of various aminoacyl l-Pro formations was observed.

Refined regio- and stereoselective hydroxylation of l -pipecolic acid by protein engineering of l -proline cis -4-hydroxylase based on the X-ray crystal structure

Koketsu, Kento; Shomura, Yasuhito; Moriwaki, Kei; Hayashi, Mikiro; Mitsuhashi, Satoshi; Hara, Ryotaro; Kino, Kuniki; Higuchi, Yoshiki

ACS Synthetic Biology4(4)p.383 - 3922015年04月-2015年04月 

PubMedDOIScopus

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概要:© 2014 American Chemical Society. Enzymatic regio- and stereoselective hydroxylation are valuable for the production of hydroxylated chiral ingredients. Proline hydroxylases are representative members of the nonheme Fe2+/α-ketoglutarate-dependent dioxygenase family. These enzymes catalyze the conversion of l-proline into hydroxy-l-prolines (Hyps). l-Proline cis-4-hydroxylases (cis-P4Hs) from Sinorhizobium meliloti and Mesorhizobium loti catalyze the hydroxylation of l-proline, generating cis-4-hydroxy-l-proline, as well as the hydroxylation of l-pipecolic acid (l-Pip), generating two regioisomers, cis-5-Hypip and cis-3-Hypip. To selectively produce cis-5-Hypip without simultaneous production of two isomers, protein engineering of cis-P4Hs is required. We therefore carried out protein engineering of cis-P4H to facilitate the conversion of the majority of l-Pip into the cis-5-Hypip isomer. We first solved the X-ray crystal structure of cis-P4H in complex with each of l-Pro and l-Pip. Then, we conducted three rounds of directed evolution and successfully created a cis-P4H triple mutant, V97F/V95W/E114G, demonstrating the desired regioselectivity toward cis-5-Hypip.

Enzymatic carboxylation of hydroxystilbenes by the γ-resorcylic acid decarboxylase from Rhizobium radiobacter WU-0108 under reverse reaction conditions

Sato, Masaru; Sakurai, Nozomu; Suzuki, Hideyuki; Shibata, Daisuke; Kino, Kuniki

Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic122p.348 - 3522015年12月-2015年12月 

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ISSN:13811177

概要:© 2015 Elsevier B.V. All rights reserved.We examined 66 aromatics for carboxylation by the γ-resorcylic acid decarboxylase from Rhizobium radiobacter WU-0108 under reverse reaction conditions. The enzyme carboxylated resorcinol, catechol, 5-methylresorcinol and three hydroxystilbenes (resveratrol, gnetol, and piceatannol) with high yields. Except for catechol, the structures of these substrates include a 1,3-dihydroxybenzene moiety. Other compounds gave no reaction products. The reaction products from resveratrol and gnetol were 2,6-dihydroxy-4-[(E)-2-(4-hydroxyphenyl)ethenyl]benzoic acid and 2,6-dihydroxy-4-[(E)-2-(2,6-dihydroxyphenyl)ethenyl]benzoic acid, respectively, as determined by mass spectrometry and nuclear magnetic resonance analyses. Kinetic analyses of the carboxylation reactions indicated that resveratrol and gnetol are better substrates than resorcinol or catechol.

Development of a multi-enzymatic cascade reaction for the synthesis of trans-3-hydroxy-l-proline from l-arginine

Hara, Ryotaro; Kitatsuji, Saki; Yamagata, Kai; Kino, Kuniki; Kino, Kuniki

Applied Microbiology and Biotechnology100(1)p.243 - 2532016年01月-2016年01月 

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ISSN:01757598

概要:© 2015, Springer-Verlag Berlin Heidelberg.Naturally occurring l-hydroxyproline in its four regio- and stereoisomeric forms has been explored as a possible precursor for pharmaceutical agents, yet the selective synthesis of trans-3-hydroxy-l-proline has not been achieved. Our aim was to develop a novel biocatalytic asymmetric method for the synthesis of trans-3-hydroxy-l-proline. So far, we focused on the rhizobial arginine catabolic pathway: arginase and ornithine cyclodeaminase are involved in l-arginine degradation to l-proline via l-ornithine. We hypothesized that trans-3-hydroxy-l-proline should be synthesized if arginase and ornithine cyclodeaminase act on (2S,3S)-3-hydroxyarginine and (2S,3S)-3-hydroxyornithine, respectively. To test this hypothesis, we cloned the genes of l-arginine 3-hydroxylase, arginase, and ornithine cyclodeaminase and overexpressed them in Escherichia coli, with subsequent enzyme purification. After characterization and optimization of each enzyme, a three-step procedure involving l-arginine 3-hydroxylase, arginase, and ornithine cyclodeaminase (in this order) was performed using l-arginine as a starting substrate. At the second step of the procedure, putative hydroxyornithine was formed quantitatively by arginase from (2S,3S)-3-hydroxyarginine. Nuclear magnetic resonance and chiral high-performance liquid chromatography analyses revealed that the absolute configuration of this compound was (2S,3S)-3-hydroxyornithine. In the last step of the procedure, trans-3-hydroxy-l-proline was synthesized selectively by ornithine cyclodeaminase from (2S,3S)-3-hydroxyornithine. Thus, we successfully developed a novel synthetic route, comprised of three reactions, to convert l-arginine to trans-3-hydroxy-l-proline. The excellent selectivity makes this procedure simpler and more efficient than conventional chemical synthesis.

Biocatalytic synthesis of 3,4,5,3',5'-pentahydroxy-trans-stilbene from piceatannol by two-component flavin-dependent monooxygenase HpaBC

Furuya, Toshiki; Sai, Masahiko; Kino, Kuniki

Bioscience, Biotechnology and Biochemistry80(1)p.193 - 1982016年01月-2016年01月 

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ISSN:09168451

概要:© 2015 Japan Society for Bioscience, Biotechnology, and Agrochemistry.HpaBC monooxygenase was previously reported to hydroxylate resveratrol to piceatannol. In this article, we report a novel catalytic activity of HpaBC for the synthesis of a pentahydroxylated stilbene. When Escherichia coli cells expressing HpaBC were incubated with resveratrol, the resulting piceatannol was further converted to a new product. This product was identified by mass spectrometry and NMR spectroscopy as a 5-hydroxylated piceatannol, 3,4,5,3',5'-pentahydroxy-trans-stilbene (PHS), which is a reportedly valuable biologically active stilbene derivative. We attempted to produce PHS from piceatannol on a flask scale. After examining the effects of detergents and buffers on PHS production, E. coli cells expressing HpaBC efficiently hydroxylated piceatannol to PHS in a reaction mixture containing 1.5% (v/v) Tween 80 and 100mM 3-morpholinopropanesulfonic acid-NaOH buffer at pH 7.5. Under the optimized conditions, the whole cells regioselectively hydroxylated piceatannol, and the production of PHS reached 6.9 mM (1.8 g L-1) in 48h.

Effective production of Pro-Gly by mutagenesis of l-amino acid ligase

Kino, Haruka; Kino, Haruka; Nakajima, Shota; Arai, Toshinobu; Kino, Kuniki

Journal of Bioscience and Bioengineering122(2)p.155 - 1592016年08月-2016年08月 

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ISSN:13891723

概要:© 2016 The Society for Biotechnology, Japan.l-Amino acid ligase (Lal) catalyzes dipeptide synthesis from unprotected l-amino acids by hydrolysis ATP to ADP. Each Lal displays unique substrate specificity, and many different dipeptides can be synthesized by selecting suitable Lal. We have already successfully synthesized Met-Gly selectively by replacing the Pro85 residues of Lal from Bacillus licheniformis (BL00235). From these results, we deduced that the amino acid residue at position 85 had a key role in enzyme activity, and applied these findings to other Lals. When Pro and Gly were used as substrates, TabS from Pseudomonas syringae, synthesized the salt taste enhancing dipeptide Pro-Gly and other three dipeptides (Gly-Pro, Pro-Pro, and Gly-Gly) was hardly synthesized from its substrate specificity. However, the amount of Pro-Gly was low. Therefore, to alter the substrate specificity and increase the amount of Pro-Gly, we selected amino acid residues that might affect the enzyme activity, Ser85 corresponding to Pro85 of BL00235, and His294 on the results from previous studies and the predicted structure of TabS. These residues were replaced with 20 proteogenic amino acids, and Pro-Gly synthesizing reactions were conducted. The S85T and the H294D mutants synthesized more Pro-Gly than wild-type. Furthermore, the S85T/H294D double mutant synthesized considerably more Pro-Gly than the single mutant did. These results showed that the amino acid position 85 of TabS affect the enzyme activity similarly to BL00235. In addition, replacing the amino acid residue positioning around the N-terminal substrate and constructing the double mutant led to increase the amount of Pro-Gly.

Functional characterization of aconitase X as a cis-3-hydroxy-L-proline dehydratase

Watanabe, Seiya; Watanabe, Seiya; Watanabe, Seiya; Tajima, Kunihiko; Fujii, Satoshi; Fukumori, Fumiyasu; Hara, Ryotaro; Fukuda, Rio; Miyazaki, Mao; Kino, Kuniki; Kino, Kuniki; Watanabe, Yasuo; Watanabe, Yasuo

Scientific Reports62016年12月-2016年12月 

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概要:©The Author(s) 2016.In the aconitase superfamily, which includes the archetypical aconitase, homoaconitase, and isopropylmalate isomerase, only aconitase X is not functionally annotated. The corresponding gene (LhpI) was often located within the bacterial gene cluster involved in L-hydroxyproline metabolism. Screening of a library of (hydroxy)proline analogues revealed that this protein catalyzes the dehydration of cis-3-hydroxy-L-proline to " 1 -pyrroline-2-carboxylate. Furthermore, electron paramagnetic resonance and site-directed mutagenic analyses suggests the presence of a mononuclear Fe(III) center, which may be coordinated with one glutamate and two cysteine residues. These properties were significantly different from those of other aconitase members, which catalyze the isomerization of α- to β-hydroxy acids, and have a [4Fe-4S] cluster-binding site composed of three cysteine residues. Bacteria with the LhpI gene could degrade cis-3-hydroxy-L-proline as the sole carbon source, and LhpI transcription was up-regulated not only by cis-3-hydroxy-L-proline, but also by several isomeric 3- and 4-hydroxyprolines.

Biotechnological production of vanillin using immobilized enzymes

Furuya, Toshiki; Furuya, Toshiki; Kuroiwa, Mari; Kino, Kuniki

Journal of Biotechnology243p.25 - 282017年02月-2017年02月 

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ISSN:01681656

概要:© 2016 Elsevier B.V. Vanillin is an important and popular plant flavor, but the amount of this compound available from plant sources is very limited. Biotechnological methods have high potential for vanillin production as an alternative to extraction from plant sources. Here, we report a new approach using immobilized enzymes for the production of vanillin. The recently discovered oxygenase Cso2 has coenzyme-independent catalytic activity for the conversion of isoeugenol and 4-vinylguaiacol to vanillin. Immobilization of Cso2 on Sepabeads EC-EA anion-exchange carrier conferred enhanced operational stability enabling repetitive use. This immobilized Cso2 catalyst allowed 6.8 mg yield of vanillin from isoeugenol through ten reaction cycles at a 1 mL scale. The coenzyme-independent decarboxylase Fdc, which has catalytic activity for the conversion of ferulic acid to 4-vinylguaiacol, was also immobilized on Sepabeads EC-EA. We demonstrated that the immobilized Fdc and Cso2 enabled the cascade synthesis of vanillin from ferulic acid via 4-vinylguaiacol with repetitive use of the catalysts. This study is the first example of biotechnological production of vanillin using immobilized enzymes, a process that provides new possibilities for vanillin production.

Discovery of lysine hydroxylases in the clavaminic acid synthase-like superfamily for efficient hydroxylysine bioproduction

Hara, Ryotaro; Yamagata, Kai; Miyake, Ryoma; Miyake, Ryoma; Kawabata, Hiroshi; Kawabata, Hiroshi; Uehara, Hisatoshi; Uehara, Hisatoshi; Kino, Kuniki; Kino, Kuniki

Applied and Environmental Microbiology83(17)2017年09月-2017年09月 

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ISSN:00992240

概要:© 2017 American Society for Microbiology. Hydroxylation via COH bond activation in the absence of any harmful oxidizing reagents is technically difficult in modern chemistry. In this work, we attempted to generate pharmaceutically important hydroxylysine from readily available L-lysine with L-lysine hydroxylases from diverse microorganisms. Clavaminic acid synthase-like superfamily gene mining and phylogenetic analysis led to the discovery of six biocatalysts, namely two L-lysine 3S-hydroxylases and four L-lysine 4Rhydroxylases, the latter of which partially matched known hydroxylases. Subsequent characterization of these hydroxylases revealed their capacity for regio- and stereoselective hydroxylation into either C-3 or C-4 positions of L-lysine, yielding (2S,3S)-3- hydroxylysine and (2S,4R)-4-hydroxylys ine, respectively. To determine if these factors had industrial application, we performed a preparative production of both hydroxylysines under optimized conditions. For this, recombinant L-lysine hydroxylaseexpressing Escherichia coli cells were used as a biocatalyst for L-lysine bioconversion. In batch-scale reactions, 531 mM (86.1 g/liter) (2S,3S)-3-hydroxylysine was produced from 600 mM L-lysine with an 89% molar conversion after a 52-h reaction, and 265 mM (43.0 g/liter) (2S,4R)-4-hydroxylysine was produced from 300 mM L-lysine with a molar conversion of 88% after 24 h. This report demonstrates the highly efficient production of hydroxylysines using lysine hydroxylases, which may contribute to future industrial bioprocess technologies.

Production of aminoacyl prolines using the adenylation domain of nonribosomal peptide synthetase with class III polyphosphate kinase 2-mediated ATP regeneration

Suzuki, Shin; Hara, Ryotaro; Kino, Kuniki; Kino, Kuniki

Journal of Bioscience and Bioengineering2018年01月-2018年01月 

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ISSN:13891723

概要:© 2017 The Society for Biotechnology, Japan. An ATP regeneration system is advantageous for industrial processes that are coupled with ATP-dependent enzymes. For ATP regeneration from AMP, a few methods have been reported; however, these methods employ multiple enzymes. To establish an ATP regeneration system using a single enzyme, we focused on class III polyphosphate kinase 2 (class III PPK2) that can synthesize ATP from AMP and polyphosphate. We constructed an ATP regeneration system from AMP using Deipr_1912, a class III PPK2 from Deinococcus proteolyticus NBRC 101906 T , coupled with aminoacyl proline (Xaa-Pro) synthesis catalyzed by the adenylation domain of tyrocidine synthetase A (TycA-A). Using this system, 0.87 mM of l-Trp-l-Pro was successfully synthesized from AMP after 72 h. Farther, addition of inorganic pyrophosphatase from Escherichia coli to the coupling reaction increased the reaction rate by 14-fold to yield 6.2 mM l-Trp-l-Pro. When the coupling reaction was applied to whole-cell reactions in E. coli BL21(DE3) pepQ - putA - , ATP was successfully regenerated from AMP by Deipr_1912, and 6.7 mM of l-Trp-l-Pro was produced after 24 h with the supplementation of 10 mM AMP. In addition, by altering the substrate amino acid of TycA-A, not only l-Trp-l-Pro, but also various other l-Xaa-l-Pro (Xaa = Val, Leu, Met, or Tyr) were produced using the whole-cell reaction incorporating ATP regeneration. Therefore, a production method for Xaa-Pro employing the adenylation domain of a nonribosomal peptide synthetase was established by introducing an ATP regeneration system that utilizes class III PPK2 with pyrophosphatase.

A chemoenzymatic process for amide bond formation by an adenylating enzyme-mediated mechanism

Hara, Ryotaro; Hirai, Kengo; Suzuki, Shin; Kino, Kuniki; Kino, Kuniki

Scientific Reports8(1)2018年12月-2018年12月 

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概要:© 2018 The Author(s). Amide bond formation serves as a fundamental reaction in chemistry, and is practically useful for the synthesis of peptides, food additives, and polymers. However, current methods for amide bond formation essentially generate wastes and suffer from poor atom economy under harsh conditions. To solve these issues, we demonstrated an alternative synthesis method for diverse tryptophyl-N-alkylamides by the combination of the first adenylation domain of tyrocidine synthetase 1 with primary or secondary amines as nucleophiles. Moreover, the physiological role of this domain is l-phenylalanine adenylation; however, we revealed that it displayed broad substrate flexibility from mono-substituted tryptophan analogues to even d-tryptophan. To the best of our knowledge, this is the first evidence for an adenylating enzyme-mediated direct amide bond formation via a sequential enzymatic activation of amino acids followed by nucleophilic substitution by general amines. These findings facilitate the design of a promising tool for biocatalytic straightforward amide bond formation with less side products.

書籍等出版物

タンパク質をデザインする

日刊工業新聞社2002年-

ナノで調べる健康状態

日刊工業新聞社2002年-

自然はナノテクの宝庫

日刊工業新聞社2002年-

発酵による有用物質生産

朝倉書店2002年-

マイトマイシンC発酵

共立出版2001年 07月-

オロチン酸発酵

共立出版2001年 07月-

L-アルギニン発酵/L-シトルリン発酵/L-オルニチン発酵

共立出版2001年 07月-

L-ヒスチジン発酵

共立出版2001年 07月-

特許

整理番号:26

短鎖脂肪酸エステルの製造方法(日本)

木野 邦器, 桐村 光太郎, 宇佐美 昭次

特願2000- 35650、特開2001-218592

整理番号:112

糖転移反応を触媒する新規な酵素をコードする遺伝子および当該酵素の製造方法(日本, PCT)

桐村 光太郎, 宇佐美 昭次, 木野 邦器, 佐藤 利行

特願2002-054853、特開2003-250559

整理番号:128

芳香族アミノ酸のラセミ化方法、芳香族アミノ酸の光学活性体の製造方法並びに芳香族ア(日本)

木野 邦器, 桐村 光太郎, 宇佐美 昭次

特願2002-215632、特開2004-570414

整理番号:147

変異制限酵素(日本)

木野 邦器, 桐村 光太郎, 宇佐美 昭次, 神垣 清威, 栗村 啓之

特願2002-064546、特開2003-259876

整理番号:194

サリチル酸、2,3-ジヒドロキシ安息香酸、またはγ-レゾルシン酸の製造方法(日本)

桐村 光太郎, 荒井 直樹, 石井 義孝, 木野 邦器

特願2002-257994、特開2004- 89132、特許第4266296号

整理番号:195

複素環硫黄化合物の分解方法(日本)

石井 義孝, 小崎 慎矢, 桐村 光太郎, 木野 邦器

特願2002-257993、特開2004- 89131

整理番号:239

マルトースホスホリラーゼによる配糖体の製造方法(日本)

木野 邦器, 桐村 光太郎, 清水 木綿

特願2002-378818、特開2004-208507、特許第4219678号

整理番号:281

脱硫関連酸化還元酵素をコードする遺伝子および取得方法(日本)

桐村 光太郎, 辻 寛子, 石井 義孝, 古屋 俊樹, 木野 邦器

特願2003-081256、特開2004-283120

整理番号:324

γ-レゾルシン酸又は2、3-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法(日本)

桐村 光太郎, 成松 由規, 草井 啓, 石井 義孝, 木野 邦器

特願2003-359110、特開2005-118002、特許第4449406号

整理番号:475

タンパク質の製造方法(日本, アメリカ)

木野 邦器

特願2005- 58193、特開2006-238772

整理番号:540

L-ビニルグリシン誘導体の製造方法(日本)

木野 邦器

特願2006-127759、特開2007-295865

整理番号:646

芳香族ヒドロキシカルボン酸合成能を有する新規微生物及び該微生物又は該微生物が産生するタンパク質を用いた芳香族ヒドロキシカルボン酸の製造方法(日本)

桐村 光太郎, 木野 邦器, 石井 義孝, 岩崎 勇一郎, 郡司 裕朗, 若山 瑠美子

特願2007- 42770、特開2008-200010、特許第5126808号

整理番号:663

α-アミノトランスフェラーゼ活性の検出方法、比活性測定法、並びにスクリーニング方法、およびα-ケト酸の定量方法(日本)

木野 邦器

特願2006-055244、特開2006-271375

整理番号:680

L-アリールグリシン誘導体の製造方法(日本)

木野 邦器

特願2006-296852、特開2008-113560

整理番号:692

油脂分解性微生物及びそれを用いた油脂含有廃水の処理方法(日本)

由井 浩, 木野 邦器

特願2007- 61109、特開2008-220225、特許第4566207号

整理番号:765

シアノフィシンの製造方法(日本)

木野 邦器, 木下 純一

特願2008-015690、特開2009-171908

整理番号:821

ペプチドの製造方法(日本)

木野 邦器, 新井 利信

特願2008-135073、特開2009-278928

整理番号:823

廃水からの窒素の回収方法及び回収装置(日本)

木野 邦器, 新井 利信

特願2008-164669、特開2010- 4754

整理番号:891

L-及びD-脂肪族アミノ酸水酸化物の製造法(日本, PCT)

木野 邦器, 原 良太郎

特願2008-271675、特開2010- 98975

整理番号:892

放線菌内で目的タンパク質を誘導発現可能なプロモーター(日本)

木野 邦器, 古屋 俊樹

特願2008-263590、特開2010- 88387

整理番号:897

二環芳香族ヒドロキシカルボン酸の製造方法(日本, PCT)

木野 邦器, 古屋 俊樹

特願2009- 933、特開2010-158177

整理番号:982

ペプチド及びペプチド誘導体の製造方法(日本)

木野 邦器, 立岩 大祐

特願2010-111751、特開2011-239686

整理番号:1033

ペプチドの製造法(日本)

木野 邦器, 新井 利信

特願2010-113150、特開2011-239707

整理番号:1034

L-スレオ-3-ヒドロキシアスパラギン酸の製造方法及び触媒組成物の組合せ(日本)

木野 邦器, 原 良太郎

特願2010-137138、特開2012- 45

整理番号:1067

芳香族水酸化酵素遺伝子及びそれを用いたフェノール誘導体の製造方法(日本)

木野 邦器, 古屋 俊樹

特願2010- 83982、特開2011-211978

外部研究資金

科学研究費採択状況

研究種別:

生体機能分子を利用したアミド化合物生産法の開発

2014年-0月-2017年-0月

配分額:¥16250000

研究種別:

任意配列オリゴペプチド合成を目指した新規ポリアミノ酸合成酵素の機能解析

2010年-0月-2013年-0月

配分額:¥4550000

研究種別:

アミノ酸水酸化酵素の効率的探索技術の開発と応用

配分額:¥13160000

研究種別:基盤研究(C)

中等度好熱性細菌を利用した微生物脱硫と高機能脱硫細菌の創製

2001年-2003年

研究分野:生物・生体工学

配分額:¥3600000

研究種別:基盤研究(C)

配糖体合成における新規グルコース縮合酵素の探索と有用配糖体の生産研究

2000年-2002年

研究分野:生物・生体工学

配分額:¥3200000

研究種別:特定領域研究(A)

ダイナミックな分子デザインと変異集積による制限酵素の改変

2000年-2000年

配分額:¥1800000

研究種別:

炭酸固定酵素による各種芳香族カルボン酸の生産および新規官能基導入酵素の探索

2018年-0月-2021年-0月

配分額:¥17810000

研究種別:

新規アミド結合反応の開発とペプチド性機能分子の創出

2016年-0月-2018年-0月

配分額:¥3640000

研究種別:

ヒドロキシチロソール生産を指向した微生物の探索、機能解析とバイオプロセス開発

2016年-0月-2019年-0月

配分額:¥3510000

研究資金の受入れ状況

提供機関:文部科学省

環境に優しい酵素に関する研究2002年-2006年

提供機関:文部科学省

微生物機能を利用した資源循環型水環境プロセスの構築1999年-2003年

学内研究制度

特定課題研究

アミノ酸リガーゼの構造機能解析とオリゴペプチド合成システムの開発

2010年度

研究成果概要:アミノ酸リガーゼは保護基を持たない遊離のアミノ酸同士を直接縮合することが可能な有用酵素である。我々は、とくにL-アミノ酸リガーゼ(Lal)に着目し、これを用いた効率的かつ汎用的なペプチド合成システムの構築を最終目標として、まずは結...アミノ酸リガーゼは保護基を持たない遊離のアミノ酸同士を直接縮合することが可能な有用酵素である。我々は、とくにL-アミノ酸リガーゼ(Lal)に着目し、これを用いた効率的かつ汎用的なペプチド合成システムの構築を最終目標として、まずは結晶構造解析により触媒残基や反応機構の詳細を解明することを検討した。Lalとしては既にBacillus licheniformis由来BL00235が結晶構造の取得に成功しているが、ここで明らかにされた情報からだけでは基質特異性などに関わる残基の特定には至らなかった。そこで、我々は新たにBacillus subtilis由来のRizA, RizBという二種類のLalについて結晶構造解析を行うこととした。RizAにおいては各種クロマトカラムを用いることで組換え酵素を高濃度(10 mg/ml)かつ高純度で精製することに成功した。さらに、蒸気拡散法による結晶化スクリーニングを検討して単結晶を得ることに成功し、X線結晶構造解析によって2.7Åの回折像を得た。分子置換法による位相決定には至らなかったが、結晶系が斜方晶系であることを明らかとすることに成功している。また、RizBに関しては組換え酵素の精製を検討中であり、完了次第結晶化条件のスクリーニングに移行する予定である。次に、既に結晶構造が解かれたBL00235について、構造情報を利用した酵素の耐熱化を検討した。酵素の耐熱性は工業レベルでの安定利用に不可欠な要素である。まず、B-FITTERと呼ばれるB-value計算プログラムを用いて構造の揺らぎを推定した。そしてBL00235において最もB-valueの高かった148位のAspを19種類のタンパク質構成性アミノ酸に置換した結果、Cysへの置換によって野生型のBL00235よりも変異型BL00235では加熱安定性が3℃ほど向上していた。

グリーンテクノロジー社会の実現を指向した新奇酵素利用バイオプロセスの開発

2011年度

研究成果概要:近年、二酸化炭素排出削減に向けてカーボンニュートラルの観点からバイオ燃料が注目を集めているが、限りある化石資源に依存した産業構造から脱却するためには燃料のみならず化学品もその原料を石油からバイオマスに転換することが重要である。また...近年、二酸化炭素排出削減に向けてカーボンニュートラルの観点からバイオ燃料が注目を集めているが、限りある化石資源に依存した産業構造から脱却するためには燃料のみならず化学品もその原料を石油からバイオマスに転換することが重要である。また、石油化学工業では物質変換に大量のエネルギー消費、二酸化炭素排出を伴うため、バイオマス由来の原料を出発物質として、温和な条件下での反応を実現する生体触媒により様々な化学品を生産できれば理想的である。植物バイオマス中にはケイ皮酸類が二次代謝産物の前駆体や中間体として広く存在し、またエステルやリグニンなどの誘導体としても多く存在する。そこで申請者らは、ケイ皮酸類をバイオマス由来のモデル原料とし、これらの出発物質から生体触媒を利用して様々な有用物質を生産するための技術開発に取り組んでいる。カフェ酸は、ケイ皮酸に水酸基が2つ結合した化合物であり、非常に高い抗酸化活性を有する。さらに抗癌活性や抗炎症活性、抗ウイルス活性も有しており、医薬中間体やポリマー原料として応用する試みも近年多数報告されている。これまでに申請者らは、ゲノム情報を利用した探索により2-ナフトエ酸に水酸基を導入するRhodopseudomonas palustris由来シトクロムP450モノオキシゲナーゼCYP199A2を見出しており、さらに本酵素の立体構造に基づいて活性中心近傍のアミノ酸に変異を導入することにより、ケイ皮酸をカフェ酸に変換する酵素の創製にも成功している。そこで本研究では、変異酵素の詳細な機能解析とカフェ酸生産への応用を中心に検討を行った。活性中心近傍に存在する185位のフェニルアラニン残基を他の9種類のアミノ酸残基に置換した。その結果、ロイシンに置換した酵素Phe185Leuではp-クマル酸に対する水酸化活性が向上し、野生型酵素の5.5倍の活性を示した。また、ロイシン、グリシン、アラニンに置換した酵素は、2段階の水酸化反応を触媒して、ケイ皮酸からm-クマル酸、p-クマル酸を経てカフェ酸を合成することが可能になった。さらに変異酵素Phe185Leuを用いてフラスコレベルでのカフェ酸生産試験を検討したところ、リッターあたりグラムスケールでの生産を達成した。

アミノ酸リガーゼの立体構造解析とオリゴペプチド合成法の開発

2012年度

研究成果概要:近年、ペプチドの持つ有用な物性や機能性に着目した開発研究が医薬品・食品・化粧品などの様々な分野で展開されている。我々はこれまで、微生物由来酵素であるL-アミノ酸リガーゼ(Lal)を利用したペプチド合成研究を展開してきた。Lalは保...近年、ペプチドの持つ有用な物性や機能性に着目した開発研究が医薬品・食品・化粧品などの様々な分野で展開されている。我々はこれまで、微生物由来酵素であるL-アミノ酸リガーゼ(Lal)を利用したペプチド合成研究を展開してきた。Lalは保護基を持たない遊離のアミノ酸を基質としてATPの加水分解反応と共役してペプチドを生成するため、発酵法などの環境負荷低減型合成プロセスへの応用展開が可能であり、物質生産において非常に優位性の高い酵素であると言える。他の研究グループの成果も含めると、様々な微生物から約20種類のLalが取得されているが、結晶構造を解くことに成功しているLalは、現在までに2例のみである。そのため各酵素に特有な基質特異性や合成されるペプチド鎖長を制御する機構を解明するためには、さらなる立体構造情報の取得が不可欠である。本研究では、複数種類のLal立体構造を明らかとし、これらの情報からLalの構造と機能との相関を考察することで上記課題を解決することを目的とした。1.1.Bacillus subtilis NBRC3134由来RizAの結晶構造解析構造解析の研究対象として、Bacillus subtilis由来のRizAおよびRizBと命名した2種類のLalを選択した。両酵素ともB. subtilisにおいてRhizocticinと呼ばれるペプチド性抗生物質の合成に関わる酵素であり、RizAはアルギニン(Arg)をN末端に配したジペプチドを特異的に合成し、一方でRizBはバリン(Val)やロイシン(Leu)などの分岐鎖アミノ酸を中心としてオリゴペプチドを合成するLalである。RizAに関しては、これまでにネイティブ酵素の単結晶から2.0Åの良好なX線回折像を得ることに成功しており、さらには多波長異常分散法による位相決定を目的としてSe-Met置換型RizAの精製工程の確立ならびに単結晶の取得にも成功している。そこで、取得したSe-Met置換型RizAの単結晶を大型放射光施設Photon factory(つくば)にてX線解析試験を行った。その結果、最大解像度2.8Åの反射を得ることに成功し、先のネイティブ酵素のデータと併せて解析することで位相の決定ならびに構造計算からRizA立体構造を解くことに成功した。RizAの全体的な構造は既に取得されている2種類のLal(YwfE:PDB ID 3VMM, BL00235:PDB ID 3VOT)の立体構造と類似しており、構造を重ね合わせた結果では、特に活性中心付近での重なりが良好であった。また、活性中心においてはRizAのN末端基質Argに対する基質特異性を決定する因子として、適切な位置に酸性アミノ酸が位置することを確認した。したがって、これらの間に電荷による相互作用が働くことで塩基性アミノ酸Argが強く認識されている可能性が示唆された。一方、RizAのC末端側のアミノ酸基質に対する特異性は低く、様々なアミノ酸が取り込まれることが確認されている。RizA構造において、C末端のアミノ酸が配すると推定される基質ポケットが空間的に広くなっており、側鎖の小さなアミノ酸から大きなアミノ酸まで許容されることが示唆された。1.2.B.subtilis NBRC3134由来RizBの結晶構造解析RizBに対してはこれまでにネイティブ酵素の精製工程を確立している。そこで精製RizBの結晶化スクリーニングを実施した。しかしながら、種々の条件を検討したが単結晶を得ることはできなかったことから、検討対象を変更し、RizBと同様の活性を示すBacillus licheniformis NBRC12200由来BL02410(一次配列相同性:約60%)について検討を行うこととした。晶析条件を見直したところ、期待通り単結晶を取得することに成功した。続いて行ったX線回折試験では、最大解像度3.0Åの反射を得ることに成功した。

化学反応と連携した新規酵素反応プロセスの開発とプロリン含有ペプチド合成への応用

2012年度

研究成果概要:アミド結合を有する化合物には機能性の高い有用物質が多いが、化学合成法では工程が煩雑で多量の縮合剤を必要と課題が多い。我々は無保護のアミノ酸を直接連結(アミド結合)してジペプチドを合成するアミノ酸リガーゼを数種類見出しているが、合成...アミド結合を有する化合物には機能性の高い有用物質が多いが、化学合成法では工程が煩雑で多量の縮合剤を必要と課題が多い。我々は無保護のアミノ酸を直接連結(アミド結合)してジペプチドを合成するアミノ酸リガーゼを数種類見出しているが、合成可能なジペプチドの種類に限度がある。とくにプロリンをC末端に配置するジペプチドやトリペプチドには血圧上昇抑制作用など有用な生理機能を有するものが多いが、従来のアミノ酸リガーゼでは合成困難なペプチドであった。Non Ribosomal Peptide Synthetase (NRPS)は、放線菌や糸状菌でリボソームとは独立してペプチド性二次代謝産物の生合成を行う巨大酵素複合体で、ペプチド合成量が少なく工業的利用は困難であるとされている。最近、我々はペプチド抗生物質チロシジンの合成を担うNRPSのモジュールの一つであるTycAを単独利用した場合、C末端にプロリンを配する直鎖状ジペプチドXaa-L-Proを高収量(~g/L)で合成できることを明らかにした。ジペプチドの生成量はプロリン濃度に依存して増大し、D-体を含むプロリン誘導体に対してもジペプチド生成が可能であることから、TycAによりチオエステル化したアミノ酸に対してプロリンのような求核活性を有する化合物が化学的に作用してジペプチドが合成されるものと推察した。実際に、TycAによってチオエステル化されたアミノ酸に対して、求核剤としてはプロリンのようなアミノ酸に限定されず、メチルアミン、ジメチルアミン、4員環から8員環までの環状アミン、さらにβ-アミノ酸やγ-アミノ酸各種アミンともアミド結合を形成することを見出した。また、求核剤となるアミノ酸のキラリティーはそのまま維持され、かつ多くのアナログ(ヒドロキシプロリン等)も取り込まれ、対応する酸アミド(ジペプチドあるいはトリペプチド)の合成も可能であることを明らかにした。基質アミノ酸活性化の観点からアデニル化に着目し、A-domain(TycA_A)のみを用いた場合にも種々のアミンを求核剤として用いることでアミド結合の形成が可能であると予想した。予想通り、ほぼ同様にアミド化合物合成が可能であった。この場合、T-domainによるチオエステル化によるホロ酵素化が必要ないため、ホスホパンテテイン転移酵素およびCoenzyme Aを必要としない簡便な合成プロセスの構築が可能で、工業的にも有用であることが示された。また、起源の異なるNRPS由来のA-domainを利用して当該反応機構の一般性を検証した。L-アスパラギン酸(L-Asp)をアデニル化するBacitracin合成酵素由来のAドメイン(BacC4_A)を用いて反応を実施した。BacC4_Aの基質をL-Aspとして、求核剤をL-Proとする反応を行ったところL-Asp-L-Proの生成を確認できた。以上の結果から、NRPSのAドメインによる基質アミノ酸のアデニル化とそれに続く求核剤の求核置換反応によりアミド結合形成が可能であることが示され、化学反応と連携した革新的かつ汎用性の高いアミド化合物合成プロセスの開発可能性を確実にした。

機能性分子としてのアミノ酸誘導体の開発とオリゴペプチドライブラリーの構築

2013年度

研究成果概要: 近年、ペプチドの持つ有用な物性や機能性に着目した開発研究が医薬品・食品・化粧品などの様々な分野で展開されている。我々はこれまで、微生物由来酵素であるL-アミノ酸リガーゼ(Lal)を利用したペプチド合成研究を展開してきた。Lalは... 近年、ペプチドの持つ有用な物性や機能性に着目した開発研究が医薬品・食品・化粧品などの様々な分野で展開されている。我々はこれまで、微生物由来酵素であるL-アミノ酸リガーゼ(Lal)を利用したペプチド合成研究を展開してきた。Lalは保護基を持たない遊離のアミノ酸を基質としてATPの加水分解反応と共役してペプチドを生成するため、発酵法などの環境負荷低減型合成プロセスへの応用展開が可能であり、物質生産において非常に優位性の高い酵素であると言える。合成可能なペプチドのバリエーションを多くすることは、ペプチドの機能性分子として有用性をさらに高めることとなり、医薬・化成品・食品など幅広い分野での利用を推進することができる。そこで、従来法による自然界からのLalの探索に加え、取得済のLalの機能改変を検討した。また、合成可能なジペプチドを中心に機能評価による新たな用途開発を見出す検討も実施した。 Lalの機能改変戦略としては、立体構造情報を踏まえた変異導入が効率的と考えられるため、本研究では、酵素特性が特異的な複数種類のLalの立体構造解析を進め、これらの情報からLalの構造と機能との相関を明らかにして、具体的な改変戦略に基づく変異酵素の創出によって、上記課題を解決することを目的とした。1.Lalの結晶構造解析 構造解析の研究対象として、Pseudomonas syringe NBRC14081由来TabSとBacillus licheniformis NBRC12200由来BL02410、およびEscherichia coli K-12由来RimKの3種類のLalを選択した。TabSは既知のLalの中で最も広範な基質特異性を有するジペプチド合成酵素であり、しかもN末端やC末端に配置される基質アミノ酸の選択性は高い。したがって、TabSの立体構造情報からはLalの基質アミノ酸認識機構の解明に重要な知見を与えるものと考えられる。高純度精製条件を見出したが、単結晶の取得には至らなかった。 BL02410はオリゴペプチド合成を有するLalである。当初、オリゴペプチド合成活性を有するLalとして、B.subtilis NBRC3134由来RizBを検討していたが、単結晶を得ることはできなかったため、同様の活性を示し一次配列相同性でも約60%であるB.licheniformis NBRC12200由来のBL02410に対象酵素を変更した。晶析条件を見直したところ、期待通り1 mmを越すネイティブ酵素の単結晶の取得に成功し、同様にSe-Met置換型酵素の単結晶の取得にも成功した。続いて行ったX線回折試験でも最大解像度3.0Åの反射を得ることができたが、解析可能なデータの取得には至らなかった。なお、タンパク質の結晶化条件検討ならびにX線回折実験は本学先進理工学部電気情報・生命工学科の胡桃坂研究室の協力を得て実施した。2.Lalの機能改変検討 特有の基質特異性を有するTabSの立体構造情報はまだ得られていないが、結晶構造が明らかになっているB.subtilis由来のLalであるYwfEの結晶構造情報(PDB ID:3VMM)と既知のLalのアミノ酸配列を比較して、TabSへの部位特異的変異の導入を検討した。その結果、292位のGlyをAspへと置換したG292Dと294位のHisをAspへと置換したH294Dを掛け合わせた二重変異型酵素(G292D/H294D)では、N末端基質のLysに対し、野生型対比で約10倍の高い親和性を示すようになり、Lys-Xaaの効率的な合成法を開発することができた。C末端に連結されるXaaには、タンパク質非構成アミノ酸であるβ-Alaのほか、γ-アミノ酪酸(GABA)、タウリン、テアニンなど生理活性作用を有する化合物も認識するようになり、Lalを利用したジペプチド合成法は、多様なアミド化合物の合成法としてその可能性が拡大した。3.Lalを利用した機能性ジペプチドの探索  ジペプチドやトリペプチドのような短鎖ペプチドには、依然として未知の機能とその用途の可能性が秘められている。既知のジペプチドで謳われている機能性は、天然のタンパク質の加水分解によって提供されるペプチドを対象に機能評価がなされてきた結果であることを踏まえて、任意のジペプチド合成が可能なLalを用いた機能開発の検討に着手した。多様なジペプチドを特異的に合成可能なTabSを用いて塩味増強効果を示すジペプチドの探索を実施した。呈味や塩味増強効果を判定するスクリーニング系を構築し、塩味増強ジペプチドとして報告されているLeu-Ser(特開2012-165740)との比較において、Met-Glyを新たに見出した。また、Bacillus licheniformis NBRC12200由来のBL00235を用いると、Met-GlyならびにLeu-Serの合成収率が高まることも見出した。なお、塩味増強効果を示すジペプチドの探索は、長谷川香料株式会社との共同研究によって実施した。

化学反応と連動した新規酵素反応プロセスと汎用的なアミド化合物合成法の開発

2013年度

研究成果概要:ペプチド、ポリマーなどの有用化合物を合成するうえで、アミド結合形成反応の実用的なプロセスが求められている。ペプチド合成において一般的に利用される固相合成法は、多量の縮合剤を必要とし、かつ煩雑な工程を繰り返す必要があり、実験室用途に...ペプチド、ポリマーなどの有用化合物を合成するうえで、アミド結合形成反応の実用的なプロセスが求められている。ペプチド合成において一般的に利用される固相合成法は、多量の縮合剤を必要とし、かつ煩雑な工程を繰り返す必要があり、実験室用途に限定される。近年、Boronic acid誘導体を触媒とするアミド合成が報告されているが(Nature, 480, 471-479, 2011)汎用的ではない。リボゾームを介したタンパク質合成システムはアミノ酸同士の結合に限定され、コモディティーケミカルの実生産において問題があるなど、現在、汎用性のあるアミド化合物合成法は確立されていない。我々は新規アミノ酸リガーゼによる革新的な短鎖ペプチド合成法の開発に成功しているが(Biosci. Biotech. Biochem., 74(1), 129-134, 2010, 他)、任意のペプチド合成には至っていない。一方、非リボソーム型ペプチド合成酵素(NRPS)はチオテンプレート機構によりリボソームとは独立してペプチド性二次代謝産物の生合成を行う巨大酵素複合体で、その反応特性と組織化された構造から、構成モジュールの組み合せによって任意のペプチド合成が可能であるが、合成収量が少なく工業的利用は困難であるとされている。我々は、NRPSのモジュールであるTycAを単独利用した場合、C末端にプロリンを配する直鎖状ジペプチドを高収量で合成できることを明らかにした。ジペプチドの生成量はプロリン濃度に依存して増大し、D-体を含むプロリン誘導体に対してもジペプチドが生成することなどから、TycAによりチオエステル化したアミノ酸に対してプロリンのような求核活性を有する化合物が化学的に作用してジペプチドが合成されるものと推察している。そこで、工業的な利用を目指し、化学反応と連動した酵素的アミド結合形成反応プロセスの開発検討を行った。① TycAモジュールを利用した各種アミド合成TycAモジュールによりL-トリプトファンをチオエステル化し、プロリン誘導体(L-アゼチジン-2-カルボン酸、cis-4-ヒドロキシ-L-プロリン、L-プロリンアミド)およびアミン類(メチルアミン、ジメチルアミン、アゼチジン)を求核剤として反応させた結果、全ての反応においてアミド化合物が生成していることを確認した。② TycAにおけるアデニル化ドメインを利用した各種アミド合成TycAモジュールはアデニル化、チオエステル化、エピメリ化の各ドメイン構造から形成される。ここで、アデニル化ドメインのみでも基質アミノ酸の活性化が可能であり、モジュールを利用した場合と同様に、アミン類を作用させることで求核置換反応が可能であると推察した。本仮説に基づき、TycAにおけるアデニル化ドメインのみを用いて①の反応を行った結果、同様に各種アミド化合物の合成が可能であった。 本研究から、アミノ酸を酵素的にチオエステル化またはアデニル化できれば、アミン類による求核置換(化学反応)によってアミド結合形成が可能であることが強く示唆された。

真核生物由来シトクロムP450型酸化酵素の酵母における発現と液晶素材合成への応用

2014年度共同研究者:古屋俊樹(Toshiki Furuya)

研究成果概要:本研究では、酸化酵素遺伝子を高発現する酵母細胞を開発し、工業的にも有用な二種類の液晶素材の合成法への応用を検討した。シロイヌナズナ由来シトクロムP450型酸化酵素遺伝子CYP73A5を酵母Schizosaccharomyces p...本研究では、酸化酵素遺伝子を高発現する酵母細胞を開発し、工業的にも有用な二種類の液晶素材の合成法への応用を検討した。シロイヌナズナ由来シトクロムP450型酸化酵素遺伝子CYP73A5を酵母Schizosaccharomyces pombeで発現させて、本組換え細胞を酸化触媒として、1.1 mM(0.21 g/L)の6-ヒドロキシ-2-ナフトエ酸合成を達成した。また、酵母Trichosporon moniliiforme由来シトクロムP450型酸化酵素遺伝子bphを酵母Pichiapastrisで発現させて、本組換え細胞を酸化触媒として、p-ヒドロキシ安息香酸の効率的合成を達成した。

新規アミド結合様式を活用したプロリン含有機能性分子の創製

2015年度

研究成果概要:Peptides containing proline residue at C-terminus (Xaa-Pro) are valuable compounds because of their antihypert...Peptides containing proline residue at C-terminus (Xaa-Pro) are valuable compounds because of their antihypertensive activity or antidiabetic activity.  Thus, they could be used as pharmaceuticals and functional foods.  We previously established the synthetic method of Xaa-Pro using adenylation domain of nonribosomal peptide synthetase.  However, the supply of expensive ATP is an obstacle to practical application.  For the inexpensive supply of ATP from AMP released after the reaction, we focused class III polyphosphate kinase 2 (PPK2) which efficiently synthesizes ATP synthesis from AMP and polyphosphate by single enzyme and constructed a novel ATP regeneration system from AMP.  Although synthesis of Xaa-Pro requires equivalent ATP, production of Xaa-Pro was more than initial concentration of ATP in the case of the ATP regeneration system was introduced.  Therefore, it was indicated that ATP was successfully regenerated form AMP by class III PPK2.  From this result, economic production method of Xaa-Pro which reduces addition of ATP is applicable to industrial process.

生体触媒を利用した有用香料成分の選択的合成法の開発

2016年度共同研究者:古屋俊樹

研究成果概要:グレープフルーツに含まれる(+)-ヌートカトン、バナナに含まれる(R)-3-ヒドロキシヘキサン酸エチル、黒胡椒に含まれる(-)-ロタンドン等は有用な香料成分であるが、現行の化学プロセスによる合成では水酸基やケトン基の選択的な導入が...グレープフルーツに含まれる(+)-ヌートカトン、バナナに含まれる(R)-3-ヒドロキシヘキサン酸エチル、黒胡椒に含まれる(-)-ロタンドン等は有用な香料成分であるが、現行の化学プロセスによる合成では水酸基やケトン基の選択的な導入が難しく、効率的ではない。そこで、生体触媒を用いた当該化合物の選択的合成法の開発を目的として、微生物由来P450酸化酵素に着目した。その結果、(-)-ロタンドン合成活性を有するP450酸化酵素を新たに見出すことに成功した。微生物由来P450酸化酵素による(-)-ロタンドンの合成は、本報告が初めてであり、新規の学術的意義に加えて、当該酵素を応用した(-)-ロタンドンの工業的生産への展開が期待できる。(+)-Nootkatone, ethyl (R)-3-hydroxyhexanoate and (-)-rotundone are included in some fruits and spices in nature, and one of the most valuable compounds in flavor and fragrance industry.  These compounds are synthesized by chemical oxidation methods so far, however, which can produce the mixture of regio- and/or enantiomeric isomers with different sensory properties.  And the requirement of subsequent purification steps invokes low recovery rates and high production costs.  Therefore, the biotechnological processes which can overcome these problems could be the powerful tool and expected as a promising alternative.  Under these backgrounds, we focused on microbial P450 monooxygenases which are widely distributed across species and participate in various oxidation steps of natural products in metabolic pathway.  Screening P450 monooxygenase gene library that we previously constructed, we successfully obtained the P450s which possess the oxidative abilities of α-guaiene to (-)-rotundone.  This is the first report of (-)-rotundone synthesis by microbial P450 monooxygenases, and this result has the potentiality to develop industrial methods for (-)-rotundone production.  Furthermore, this method can apply to the selective synthesis of other flavor compounds, and which leads to the construction of industrially advantageous processes.

AMPからのATP再生系の構築と物質生産プロセスへの展開

2017年度

研究成果概要: 高価なATPを利用する酵素反応による有用物質生産の実用化においてコスト低減は重要な課題である。反応で生成するADPやAMPをATPに再生する従来のシステムでは、例えば、AMPからの再生には複数の酵素が必要で反応系も複雑になるなど... 高価なATPを利用する酵素反応による有用物質生産の実用化においてコスト低減は重要な課題である。反応で生成するADPやAMPをATPに再生する従来のシステムでは、例えば、AMPからの再生には複数の酵素が必要で反応系も複雑になるなど課題も多い。 本研究では、ポリリン酸を利用してAMPからADPを経由してATPを合成するclass III polyphosphate kinase 2と、ホスホエノールピルビン酸とAMPおよびピロリン酸からATPを生成するpyruvate phosphatedikinaseに着目した。この2つの異なる単一酵素によるAMPからのATP再生系を構築し、実際のATP利用反応系においてもその有効性を示すことに成功した。

発酵法による有用アミノ酸生産プロセスの開発研究と生産機構の解析

1999年度

研究成果概要: L-ヒスチジン(HIS)は胃潰瘍、貧血の治療薬など医薬品としてのほか、食品添加物や化学品としてもその用途は広く、世界で約400T/年が生産されている。そのほとんどを供給している協和発酵では、糖蜜を主炭素源としコリネ型グルタミン酸... L-ヒスチジン(HIS)は胃潰瘍、貧血の治療薬など医薬品としてのほか、食品添加物や化学品としてもその用途は広く、世界で約400T/年が生産されている。そのほとんどを供給している協和発酵では、糖蜜を主炭素源としコリネ型グルタミン酸生産菌の変異株を用いた発酵法により生産しているが、本生産菌では生産されるHISと等モルのグリシン(Gly)を副生するため、大幅な成績向上が期待できず、またGlyの生理的特性から生産菌活性の低下が余儀なくされている。一方、糖蜜産出国における精糖技術の向上とグルタミン酸発酵工業の隆盛等によって、我国など諸外国へ輸出される糖蜜の価格上昇や品質の低下は著しく、発酵成績の低下や製品品質への影響が問題となっている。さらに発酵廃液処理に関わる環境対策も解決すべき大きな課題である。こうした状況を踏まえ、我々は大腸菌を生産菌株として選定し、従来の知見も生かしつつ変異育種にて効率的に生合成制御の解除を図り、生産性の高い実用菌株の造成に成功した。(特許出願)

酸素改変による新規代謝系の構築と工業用微生物の創製

2002年度共同研究者:桐村 光太郎

研究成果概要:【工業用微生物の生育制御システムの開発】 発酵生産菌の生育を自由に制御することができれば,発酵時間の短縮や目的産物の発酵収率を高めることが可能となる.実際,工業生産では栄養要求性変異を付与した微生物が用いられているが,こうした変異...【工業用微生物の生育制御システムの開発】 発酵生産菌の生育を自由に制御することができれば,発酵時間の短縮や目的産物の発酵収率を高めることが可能となる.実際,工業生産では栄養要求性変異を付与した微生物が用いられているが,こうした変異株の取得はネガティブ選択であり,また添加する栄養要求物質によってはコスト高,あるいは精製に影響を及ぼす場合もある.メチオニンは安価で,その要求株は安定な生産実績を示すことが知られている.我々は,鋭意検討した結果,メチオニンの少量存在下で取得した大腸菌のDL-エチオニン耐性株の中から高頻度にメチオニン要求株が得られることを見出し(取得頻度:37%),従来法に比較するとその取得効率は800倍以上であった.遺伝子解析の結果,いずれもmetBかつmetJ変異株であり,メチオニン要求性とDL-エチオニン耐性変異が検証され,また取得温度との関係も見出された.現在,metBとmetJへの部位特異的二重変異導入頻度の高い理由を解析中.【エネルギー代謝酵素を利用した発酵生産収率の向上と形質転換系の構築】 クエン酸生産菌である糸状菌Aspergillus nigerには,ミトコンドリア内に通常のチトクロム鎖とは別に酸化的リン酸化を伴わない呼吸系バイパス酵素alternative oxidase (AOX) が存在し,クエン酸生産とAOX活性がリンクしていることを見出している.A. niger WU-2223L由来のAOXをコードする全長2856bpの染色体遺伝子aox1の一部を欠失させ,相同組換え手法によりaox1破壊株を取得し,特性解析を実施した.サザンハイブリダイゼーションとPCR増幅によってaox1破壊を確認できた形質転換株A. niger⊿aox1-1は,AOX活性の特徴であるシアン非感受性呼吸が消失しており,糖代謝活性ならびにクエン酸生産活性の低下が認められた.また,形質転換マーカーとして重要なpyrG破壊用プラスミドを作成.【有用酵素の機能改変と大腸菌における高発現化】 遺伝子操作ツールとして重要な制限酵素BamHIの耐熱化をコンピュータシミュレーションと部位特異的変異の導入により達成.当該酵素の高発現はBamHIの制限系と修飾系酵素遺伝子の同時発現が必須であるが,大腸菌においては修飾系酵素遺伝子の発現が律速であることを明らかにした.解析の結果,転写には問題はなくレアコドンの影響で翻訳効率が低くなっていることが判明し,アルギニンに対応するtRNA遺伝子dnaYの共発現によって高発現を達成.

アミノ酸ラセマーゼの機能改変とD-アミノ酸誘導体生産法の確立

2004年度

研究成果概要:【アミノ酸ラセマーゼの機能改変と解析】公開されているゲノム情報を利用して低基質特異性のPseudomonas putida IFO12996由来のアミノ酸ラセマーゼ遺伝子をクローニングし、error-prone PCRによる遺伝子...【アミノ酸ラセマーゼの機能改変と解析】公開されているゲノム情報を利用して低基質特異性のPseudomonas putida IFO12996由来のアミノ酸ラセマーゼ遺伝子をクローニングし、error-prone PCRによる遺伝子のランダム変異導入を実施した。L-トリプトファン要求性の大腸菌を用いて変異クローンライブラリーを構築し、D-トリプトファンで要求性が相補される変異クローンを取得して活性を評価した。その結果、期待通り活性の増大した変異クローンを取得できた。本クローンは芳香族アミノ酸であるフェニルアラニンに対する活性も増大しており、他のポジティブクローンと併せ詳細検討中。また、変異部位も特定しており、ネイティブ酵素遺伝子に対して部位特異的変異導入によって、取得変異クローンの活性変化の検証を進めている。【D-アミノ酸リガーゼの解析とD-アミノ酸ジペプチド合成法の開発】E. coli K 12由来のD-アラニン-D-アラニンリガーゼ(Ddl)をゲノム情報をもとにクローニングし、His-Tag融合酵素として大腸菌で発現させた。D-Alaに加え,D-Ser,D-Thr,D-Cys,Glyを基質とした場合にも活性に差はあるものの、それぞれ対応するD-アミノ酸からD-アミノ酸ホモジペプチドが生成していることを確認した。バンコマイシン耐性腸球菌(VRE)の変異型DdlがC末端側にD-AlaではなくD-Serを連結することは既に報告されているが、VRE以外の微生物のDdlがD-Ala 以外のアミノ酸も基質にすることに加え、C末端側だけではなくN末端側にもD-Ser,D-Thr,D-Cys,Glyが挿入される基質特異性のあることを明らかにしたのは本研究が初めてとなる。D-アラニル-D-アラニン,D-セリル-D-セリン,D-スレオニル-D-スレオニン,D-システイニル-D-システイン,グリシル-グリシンは収率にして71,71,2,60,77%での合成に成功し、Ddlを利用したD-アミノ酸ジペプチド合成プロセスの有効性を示した。【アミノ酸ラセマーゼ/D-アミノ酸リガーゼ共役系によるL-アミノ酸からD-アミノ酸ジペプチド合成法の開発】 E. coli K 12由来のDdlは立体特異性が厳密なため、D-アミノ酸だけでなくラセミ体混合基質からも目的のD-アミノ酸ジペプチドを生成する。この時、アミノ酸ラセマーゼを作用させることでラセミ体中のL-アミノ酸も基質として利用できるようになり、さらには安価に供給できるL-アミノ酸のみからのD-アミノ酸ジペプチド合成も可能となる。 上述の低基質特異性のPseudomonas putida IFO12996由来のアミノ酸ラセマーゼとDdlを共役させてL-アミノ酸からのD-アミノ酸ジペプチド合成を検討した。L-Ala、L-Ser、L-Cysから反応7時間で対応するD-アミノ酸ジペプチドをそれぞれ収率44%、36%、9%で合成することができた。D-アミノ酸を原料とする場合に比べ収率は低いものの、L-アミノ酸ジペプチドの副生は予想通り認められず、本プロセスではL-アミノ酸のラセミ化とD-アミノ酸ジペプチドの合成を一段階の反応で行うことができる。

非天然型ペプチド生産を目的とした新規生体触媒の開発とバイオプロセスの確立

2005年度

研究成果概要:【低基質特異性アミノ酸ラセマーゼの機能改変と解析】 Pseudomonas putida IFO 12996が生産する低基質特異性アミノ酸ラセマーゼは中性、塩基性アミノ酸に対し広範なラセミ化活性を示すユニークな酵素である。当該酵素...【低基質特異性アミノ酸ラセマーゼの機能改変と解析】 Pseudomonas putida IFO 12996が生産する低基質特異性アミノ酸ラセマーゼは中性、塩基性アミノ酸に対し広範なラセミ化活性を示すユニークな酵素である。当該酵素を利用して、安価なL-アミノ酸を出発原料としたD-アミノ酸生産プロセスを検討しているが、酵素工学的な見地からの基質認識機構は未解明のままである。そこで基質特異性の変化した改変酵素を取得し、遺伝子配列、タンパク質レベルの比較解析を行うことで当該酵素の基質認識機構を解明することを検討した。さらに、広範な基質特異性を示す高機能アミノ酸ラセマーゼを用いた工業的なD-アミノ酸生産法の開発研究も行った。 これまでに低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ遺伝子へのランダム変異導入を行い、トリプトファンに対して顕著な活性を示す改変酵素を5種類取得した。これらの改変酵素の変異部位の解析から、384位のイソロイシン残基、396位のチロシン残基が当該酵素の全体的な活性の向上とトリプトファン特異的な活性向上に寄与していることが示唆された。そこで、両残基をタンパク質を構成する20種類のアミノ酸すべてで置換した変異体を作成したところ、384位では疎水的な脂肪族アミノ酸への置換が、396位では側鎖に水酸基、チオール基を有するアミノ酸への置換が当該酵素の活性を向上させることを明らかにした。現在は反応速度論的解析や分光学的解析に加えタンパク質立体構造モデリングによる解析も含めた両残基でのアミノ酸置換による活性向上のメカニズムを検討中である。【D-アラニン-D-アラニンリガーゼによるD-アミノ酸ジペプチド合成】D-アミノ酸含有ペプチド(D-アミノ酸ペプチド)は天然のペプチドとは異なる機能を示し,医薬原料,機能性食品としての用途開発が期待される。本研究では、細菌の細胞膜生合成の過程で機能するEscherichia coli K-12由来のD-アラニン-D-アラニンリガーゼ(Ddl)が反応機構、基質特異性の点でD-アミノ酸ジペプチド合成に有用な酵素であることを明らかにしてきた。Ddlは多くの細菌の生育に必須な酵素であり、類縁酵素はその遺伝子配列も含めてゲノムデータベースより容易に取得可能である。そこで、遺伝子配列が既知の好熱性細菌Thermotoga maritimaに着目し、当該菌のDdlホモログ(TmDdl)の耐熱性と高温反応における基質特異性を検討することで、より多様なD-アミノ酸ジペプチド合成法の確立を検討した。これまでに、TmDdlがDdl活性を示し、常温での反応でもD-アラニン、D-セリン、D-スレオニン、D-システイン、グリシンを基質とする基質特異性の広いDdlであることを明らかにしてきた。そこで、当該酵素の耐熱性を測定したところ、TmDdlは10ºCから90ºCの範囲において熱安定性を示し、その反応速度は温度の上昇に伴って顕著に増大した。さらに60ºCの高温条件下ではTmDdlの基質特異性が拡張し,常温反応では合成が困難であったD-メチオニン、D-フェニルアラニンなどを含有する数種類のD-アミノ酸ジペプチドの合成にも成功した。さらにTmDdlが反応に必要とする微量のMg2+イオンを他の2価のカチオンで置換することで基質特異性が変化することを示唆する結果も得た。このようにTmDdlは高い安定性と広範な基質特異性を示す新規なDdlであり、効率的なD-アミノ酸ジペプチド合成法の開発に大きく寄与できるものと考えられる。

構造と活性相関に基づくペプチド合成酵素の分子設計

2007年度

研究成果概要:我々は、多様な生理活性機能を有するペプチドの効率的な供給を目的として、ATPの加水分解反応を介し遊離アミノ酸同士の連結反応を触媒するアミノ酸リガーゼに着目し、特性の異なる新規アミノ酸リガーゼの探索や発現、当該酵素を利用した短鎖ペプ...我々は、多様な生理活性機能を有するペプチドの効率的な供給を目的として、ATPの加水分解反応を介し遊離アミノ酸同士の連結反応を触媒するアミノ酸リガーゼに着目し、特性の異なる新規アミノ酸リガーゼの探索や発現、当該酵素を利用した短鎖ペプチド合成プロセスの開発研究を実施してきた。一方、オリゴペプチドへの新たな展開を考え、その効率的な合成法を可能にする酵素としてCyanophycin合成酵素に着目した。本研究では、短鎖ペプチド合成酵素研究での知見を踏まえ、分子設計を中心としたタンパク質工学的な手法によるCyanophycin合成酵素からの新規なオリゴペプチド合成酵素の創製を目的とした。Cyanophycinは、シアノバクテリア(藍藻類)が菌体内に蓄積するポリペプチド(分子量:25~100 kDa)で、Aspが-ペプチド結合をした骨格にArgがAspの-カルボキシル基でペプチド結合した構造を有している。この独特な構造に着目し、遊離のAspとArgからのCyanophycin合成、さらには遊離アミノ酸からの任意オリゴペプチド合成を可能とする酵素の存在可能性を推定した。そこで、ゲノム情報を活用し、種々のシアノバクテリアからCyanophycin合成酵素を取得し、活性評価を行った。その結果、Thermosynechococcus elongatus BP-1由来のCyanophycin合成酵素において期待する活性を見出すことに成功した。さらに、本酵素の基質特異性は、極めて厳密であることもわかった。また、本酵素が2つの活性ドメインを有することから、酵素の構造-活性相関に関する情報を得るために各機能ドメインでの分割を試みたが、いずれのタンパク質もペプチド合成活性を示さなかった。今後、本酵素特性の詳細な解析やドメインの分割位置の最適化を検討し、基質特異性等の機能改変へと展開していく予定である。

構造と活性相関に基づく新規ペプチド合成酵素の創製とポリペプチド生産への応用

2008年度

研究成果概要:我々は、ペプチドの効率的な生産法確立を目的として、ATPの加水分解反応と共役して遊離アミノ酸同士の連結反応を触媒するアミノ酸リガーゼに着目した研究を進めている。特にL-アミノ酸リガーゼを用いた短鎖ペプチド合成研究において、これまで...我々は、ペプチドの効率的な生産法確立を目的として、ATPの加水分解反応と共役して遊離アミノ酸同士の連結反応を触媒するアミノ酸リガーゼに着目した研究を進めている。特にL-アミノ酸リガーゼを用いた短鎖ペプチド合成研究において、これまで目覚しい成果をあげてきたが、オリゴならびにポリペプチド合成への新たな展開を考え、オリゴペプチドを合成可能な新規L-アミノ酸リガーゼを探索するとともに、他のリガーゼ酵素としてCyanophycin合成酵素に着目し、構造-活性相関に基づくCyanophycin合成酵素からの新規なポリペプチド合成酵素の創製を検討している。我々は、遊離アミノ酸を原料としてCyanophycinを直接合成できるプライマー非依存的な新規酵素の取得に成功している。本酵素は2つの活性ドメインを有している。そこで、酵素の構造-活性相関に関する情報を取得するためにD-Ala-D-AlaリガーゼやMurリガーゼなどとの一次配列の比較からATPとの結合に関わる活性残基を推定し、Alaに置換した変異酵素をいくつか作製した。これらの中でK261AならびにK497A変異酵素において活性の消失を確認し、活性に関わる残基の一部を特定することに成功した。また、一方で新規L-アミノ酸リガーゼの探索を目的として、微生物の生産するトリペプチド性の二次代謝産物(ファゼオロトキシン、リゾクチシン)に着目し、これらの合成酵素を探索した。その結果、いずれの検討においてもトリペプチド構成要素となるジペプチドの合成活性を有する酵素の取得に成功した。今後、これら近傍の遺伝子領域を解析することでトリペプチド合成を可能とする新規酵素が取得されることが期待されるとともに、Cyanophycin合成酵素との比較によって、構造-活性相関に関する知見を蓄積し、新規ペプチド合成酵素の創製へとつなげていくことを予定している。

L-アミノ酸リガーゼのライブラリー構築と効率的ペプチド合成プロセスの開発

2009年度

研究成果概要:我々は、ペプチドの効率的な生産法確立を目的として、ATPの加水分解反応と共役して遊離アミノ酸同士の連結反応を触媒するアミノ酸リガーゼに着目した研究を進めている。特にL-アミノ酸リガーゼを用いた短鎖ペプチド合成研究において、これまで...我々は、ペプチドの効率的な生産法確立を目的として、ATPの加水分解反応と共役して遊離アミノ酸同士の連結反応を触媒するアミノ酸リガーゼに着目した研究を進めている。特にL-アミノ酸リガーゼを用いた短鎖ペプチド合成研究において、これまで目覚しい成果をあげてきたが、オリゴならびにポリペプチド合成への新たな展開を考え、報告例のないオリゴペプチドを合成可能な新規L-アミノ酸リガーゼを探索するとともに、他のペプチド合成酵素としてNRPS(Non-Ribosomal Peptide Synthesis)や新規ポリアミノ酸合成酵素など新領域での酵素探索も推進した。微生物の生産するトリペプチド性の二次代謝産物に着目し、これら生産菌からの合成酵素の探索を検討した。その結果、トリペプチド以上のオリゴペプチドの合成活性を有するジペプチド合成酵素RizAの取得に成功した。リゾクチシン生産菌からは、精製酵素のN末端配列を決定して得た新規アミノ酸配列の酵素を取得した。さらに、当該酵素遺伝子の周辺領域の解析によって、トリペプチド以上のオリゴペプチド合成を可能とする初めてのリガーゼ酵素RizBの発見にも成功した。また、遺伝子クラスターの解析を進め、抗生物質リゾクチシンの生合成経路を推定することもできた。さらに、オリゴペプチド合成を可能とするRizBのアミノ酸配列情報を基にin silicoスクリーニングを実施し、新たに6種類のオリゴペプチド合成反応を触媒する酵素を見出すことにも成功した。現在、取得した多様なジペプチドならびにオリゴペプチド合成酵素を組み合わせ、任意のオリゴペプチド合成システムの開発を目指し検討を行っている。これまでに固定化酵素を用いた基本プロセスの構築に成功しており、具体例として血圧上昇抑制効果のある有用トリペプチドの生産も可能となった。

現在担当している科目

科目名開講学部・研究科開講年度学期
生物化学先進理工学部2019秋学期
生物化学  【前年度成績S評価者用】先進理工学部2019秋学期
応用化学総論先進理工学部2019春学期
応用化学総論  【前年度成績S評価者用】先進理工学部2019春学期
応用化学実験II先進理工学部2019春学期
応用化学実験II  【前年度成績S評価者用】先進理工学部2019春学期
応用化学専門演習先進理工学部2019秋学期
応用化学専門演習  【前年度成績S評価者用】先進理工学部2019秋学期
工業化学実験I先進理工学部2019秋学期
工業化学実験I  【前年度成績S評価者用】先進理工学部2019秋学期
卒業論文先進理工学部2019通年
卒業論文  【前年度成績S評価者用】先進理工学部2019通年
工業化学実験II先進理工学部2019春学期
工業化学実験II  【前年度成績S評価者用】先進理工学部2019春学期
上級生物化学先進理工学部2019春学期
Graduation Thesis A先進理工学部2019秋学期
Graduation Thesis B先進理工学部2019春学期
修士論文(応化)大学院先進理工学研究科2019通年
Research on Applied Biochemistry大学院先進理工学研究科2019通年
応用生物化学研究大学院先進理工学研究科2019通年
Advanced Biochemistry大学院先進理工学研究科2019春学期
生物化学特論大学院先進理工学研究科2019春学期
バイオテクノロジー特論大学院先進理工学研究科2019春学期
応用化学特別実験大学院先進理工学研究科2019通年
特定課題演習・実験大学院先進理工学研究科2019通年
応用化学研究倫理大学院先進理工学研究科2019集中講義(春学期)
応用化学研究倫理大学院先進理工学研究科2019集中講義(春学期)
Seminar on Applied Biochemistry A大学院先進理工学研究科2019春学期
応用生物化学演習A大学院先進理工学研究科2019春学期
Seminar on Applied Biochemistry B大学院先進理工学研究科2019秋学期
応用生物化学演習B大学院先進理工学研究科2019秋学期
Master's Thesis (Department of Applied Chemistry)大学院先進理工学研究科2019通年
応用生物化学研究大学院先進理工学研究科2019通年
実践的化学知演習A大学院先進理工学研究科2019通年
実践的化学知演習B大学院先進理工学研究科2019通年

作成した教科書・教材・参考書

発酵ハンドブック

2001年

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概要:共立出版 L−ヒスチジン発酵、L−アルギニン発酵/L−シトルリン発酵/L−オルニチン発酵、オロチン酸発酵、マイトマイシンC発酵

生命工学への招待ー基礎と応用ー

2002年

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概要:発酵による有用物質生産(朝倉書店)

その他教育活動

早稲田大学理工学部入学オフィス室長等

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概要:室長、副室長として、学部長室の入学関連業務のサポートを実施。全国の高等学校や予備校の訪問・講義・面談を実施。

鳥取大学工学部非常勤講師

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概要:非常勤講師として、同大学学部および大学院の教科を担当

大阪大学工学部・同大学院工学研究科非常勤講師

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概要:非常勤講師として、同大学および同大学院の専門科目を担当

東京都立戸山高等学校運営連絡協議会委員

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概要:多くの要人を輩出した名門都立高校である同校の教育等の運営に関して、年数回の委員会に参加し、今後の目指すべき理想の高校つくりの議論に参加する

東京都立戸山高等学校SSH運営指導委員会委員

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概要:都立高校としては初めて文部科学省のスーパーサイエンスハイスクールとして認定された、戸山高等学校の運営指導員会委員として、各種会合に参加し、成果報告書の作成にも協力